Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von drei verschiedenen Serien von bivalenten Estrogenrezeptor(ER)-Liganden, die abhängig von der Struktur des jeweiligen Liganden (Diethylstilbestrol, Raloxifen, und 4-Hydroxy Tamoxifen) durch variable Abstandhalter miteinander verbunden sind. Die bivalenten Liganden wurden sowohl bezüglich ihrer biologischen Aktivität, als auch ihrer Bindungsaffinität und -fähigkeit zum Estrogenrezeptor hin untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden bivalente trans- Diethylstilbestrolanaloga (DES) über variable Abstandshalter aus Oligoethylenglycolstrukturen oder Oligoethylenglycol-Konjugaten (die, z.B. eine starre Biphenoleinheit enthalten) miteinander verbrückt. In vitro Studien zeigten, dass eine polare Amid-Verknüpfung am bivalenten Liganden die Bindungsaffinität zum Rezeptor, im Vergleich zum monovalenten Liganden, dramatisch verringert. Als Folge wurden nur sehr schwache Bindungsaffinitäten beobachtet, wobei die kurzkettigen (10.8 Å), bivalenten Diethylstilbestrolanaloga höhere Bindungsaffinitäten als die Langkettigen (34.8 und 46.7 Å) zeigten. Unter den langkettigen Analogien zeigte, der bivalente Ligand die höchste Affinität, der über eine 43.1 Å lange Oligoethylenglycoleinheit verbrückt ist. Die Differenz der Bindungsaffinitäten vom mono- zum bivalenten Analogon lässt vermuten, dass es zu einer unerwarteten Wechselwirkung zwischen der zweiten Diethylstilbestrol Komponente und der Rezeptoroberfläche kommt. Darüber hinaus konnte eine Computer Simulation zeigen, dass zum einen der Abstand zwischen den beiden Diethylstilbestrolanaloga durch Faltung verkürzt ist, und zum Anderen, dass es zu einer hydrophoben Wechselwirkung zwischen den beiden Diethylstilbestrol- Komponenten und den starren Oligoethylenglycol-Konjugaten kommt.[29] Um die Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAB) der bivalenten Estrogenrezeptoren besser verstehen zu können, wurden im zweiten Teil dieser Arbeit bivalente Raloxifene (RAL), die durch flexible Oligoethylenglycolstrukturen unterschiedlicher Länge (4.7-47.7 Å) verbrückt wurden, synthetisiert und untersucht. Um deren unterschiedliche Bindungsaffinitäten erklären zu können, wurden zwei verschiedene Bindungsmodi, entweder intra- oder intermolekularer Art vermutet (Abbildung 1a). Es zeigte sich, dass 22.7 Å der kritische Mindestabstand ist, bei dem die intra- und intermolekulare Ligandenbindungsdomäne vom ERα-Dimer gerade noch unterschieden werden können. Die maximal intermolekulare, bivalente Bindungsaffinität (10% Relative Bindungsaffinität (RBA, bezogen auf Estradiol (E2)) wurde bei einem Abstand von 26.7 Å erreicht. Bemerkenswerterweise wurde experimentell bestätigt, dass bivalente Liganden, die über einen langen Abstandshalter miteinander verknüpft sind, schwächere Bindungsaffinitäten aufgrund von Liganden-Abschirmung und Faltung der Oligoethylenglycolstrukturen aufweisen. Im Gegensatz dazu können bivalente Liganden, verbunden über kürzere Abstandshalter, leichter an den Rezeptor binden. Als Konsequenz zeigen solche Liganden stärkere Bindungsaffinitäten zum Estrogenrezeptor (Abbildung 1b). So hat der Unterschied in Entropie (die Faltung der Kette) und Enthalpie (intramolekulare Wechselwirkungen) zwischen der ursprünglichen und finalen Konformation der bivalenten Raloxifenanaloga einen großen Einfluss auf die Protein-Ligand Wechselwirkung. Darüber hinaus haben die bivalenten Raloxifenanaloga durch den Mangel an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Proteinrest (ASP351) und den 1,2,3-Triazolgruppen einen unerwünschten enthalpischen Einfluss auf die Ligand-Rezeptor Wechselwirkung.[30] Um die unerwünschte Verminderung der Bindungsaffinität des Estrogenrezeptors, bedingt durch strukturelle Modifizierung der bivalenten Raloxifenanaloga, zu vermeiden, wurde ein neuer bivalenter Ligand basierend auf einem monovalenten Estrogenrezeptor konzipiert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden bivalente cis-4-Hydroxytamoxifen (OHT)-Derivate, basierend auf monovalenten cis-OHT Liganden, verbrückt über Oligoethylenglykolketten im Längenbereich von 7.2-43.1 Å, untersucht. Diese Derivate wurden bezüglich ihrer Bindungsaffinität zu den Estrogenrezeptor-Subtypen α und β (ERα und ERβ) untersucht. Obwohl ihre ER-Bindungsmöglichkeiten durch die unerwünschte Konformation in wässriger Umgebung vermindert ist,[30] finden sich zwei Affinitätsmaxima bei den Abstandslängen 14.4 und 28.8 Å (bis zu 37% und 31% RBA von E2, Abbildung 1c), welche mit intra- bzw. intermolekularen bivalenten Bindungsmodi korrespondieren. Diese Ergebnisse stimmen nicht nur mit unserer ursprünglichen Hypothese überein, sondern liefern auch ein intuitives und präzises Verständnis der SAB von bivalenten Estrogenliganden beider ER- Subtypen, insbesondere für ERβ. Basierend auf den unterschiedlichen ER- Bindungsaffinitäten der hier vorgestellten, bivalenten Estrogenliganden wurde hinreichend gezeigt, dass zahlreiche Faktoren, wie z.B. Estrogen-agonistische- oder Estrogen-antagonistische Eigenschaften, für das bivalente Estrogen- Liganden-Design berücksichtigt werden müssen. Erstens, Antagonisten, wie Raloxifen und 4-Hydroxytamoxifen besitzen durch ihre jeweilige Seitenkette einen leichteren Zugang zu der antagonistischen Bindungsstelle des Estrogenrezeptors. Im Gegensatz dazu, können Agonisten nur durch Modifikation der steroidalen Struktur in der Position 17 α so einen Zugang erhalten. Diese Änderung hätte jedoch eine Abnahme der ER-Bindungsaffinität zur Folge. Im Vergleich, wiesen bivalente Ethinylestradiol (EE2)-Liganden von LaFrate[124] sehr viel höhere Bindungsaffinitäten auf, als bivalente E2-Liganden,[120,121] da sie an der besagten Position keine entsprechende Modifikation besitzen. Zweitens, die Bindungsposition und die Abstandshalter sollten konsistent mit der Umgebung des jeweilig gebundenen Estrogenliganden sein. Im Falle des bivalenten trans-DES-Liganden wurde die Estrogenrezeptor-Bindungsaffinität durch die Einführung einer hydrophilen Amidgruppe dramatisch reduziert. Im Umkehrschluss kann die tertiäre Amingruppe von 4-Hydroxytamoxifen die hydrophile Wechselwirkung zu Proteinresten aufrecht erhalten und schlussendlich weisen bivalente cis-OHT Liganden eine höhere ER- Bindungsaffinität als ihre Raloxifenanaloga auf. Drittens, die Verwendung einer rigiden Einheit, die ursprünglich von Whitesides postuliert wurde, kann den entropischen Verlust der Konformation minimieren und die Bindungsaffinität erhöhen, solange keine intramolekularen Wechselwirkungen zwischen dieser starren Einheit und dem gebundenen Liganden auftritt. Ein gutes Beispiel ist gegeben durch bivalente Estrogenliganden, die über rigide DNA Abstandshalter verbrückt sind.[198] Im Gegensatz dazu, wurde im Fall von flexiblen Abstandshaltern entdeckt, dass intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Bisphenylsegmenten des Abstandshalters und verbrückten trans-DES- Liganden eine signifikante Reduktion der ER-Bindungsaffinität hervorrufen.[29] Letztendlich können durch den Einsatz von flexiblen Abstandshaltern verschiedene strukturelle Anforderungen, wie z.B. der Winkel zwischen den Liganden und/oder die Abstandshalterlänge erbracht werden. Die Möglichkeit besteht nicht bei Verwendung von rigiden Abstandshaltern. Die Flexibilität von Polyether-Abstandhaltern erhöht dennoch die strukturelle Unbestimmtheit der Liganden aufgrund der Konformationsfaltung und hydrophoben-hydrophoben Wechselwirkung der verbrückten Estrogenanaloga.[30] Schlussfolgernd lässt sich feststellen, dass das Erreichen einer hohen Affinität bivalenter Verbindungen zu dimeren ER-Ligandenbindungsdomäne eine große Herausforderung darstellt. In dieser Arbeit wurde die Struktur-Aktivitäts-Beziehung von bivalenten Estrogenliganden, die durch variable Abstandshalter unterschiedlicher Länge verbrückt sind, etabliert. Zwei bivalente ER-Bindungsmodi, intra- und intermolekular, die essentiell für das Design von hochaffinen, bivalenten Estrogenliganden sind, wurden vorgestellt und bestätigt. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass das Erreichen von bivalenter Bindung zu dimeren Estrogenrezeptoren nicht einfach nur durch Struktur-Aktivität-Bestimmung, wie z.B. Wahl eines geeigneten Abstandshalters um zwei Liganden miteinander zu verbrücken, erreicht wird, sondern, dass ein systemisches Verständnis über das Bindungsverhalten vom bivalenten Liganden an den Estrogenrezeptor und die intramolekularen hydrophilen, bzw. hydrophoben Wechselwirkung in der wässrigen Umgebung berücksichtigt werden müssen. Darüber hinaus muß eine weitere Untersuchung der intramolekularen, bivalenten Bindung am Estrogenrezeptor gewährleistet werden. Bivalente Liganden, die über kurze Oligoethylenglykoleinheiten (Kettenlänge ca. 10 - 14 Å) verbrückt sind, bieten eine neue Möglichkeit für die Synthese von hochaffinen Inhibitoren, um eine Estrogenrezeptor-Coaktivator-Wechselwirkung zu verhindern.
In this thesis a convergent synthetic route was carried out to prepare three series of bivalent estrogen ligands tethered by flexible spacers of varying length according to the structure-based ligand design. These bivalent ligands were not only biologically evaluated with estrogen receptor (ER) to determinate their ER-binding affinities but also investigate via different methods to explain their ER-binding abilities. In the first part of the work bivalent trans-diethylstilbestrol (DES) ligands tethered by oligoethylene glycol (OEG) or hybrid OEG spacers (e.g. containing a rigid biphenyl segment) with lengths in the range of 34.8-46.7 Å were studied. It was found that the polar amide linkage group of these bivalent ligands results in a dramatic decrease in the ER binding affinity compared to the original monovalent DES ligand and therefore, only weak binding affinities were observed. Among these bivalent DES ligands, bivalent DES ligand tethered by a OEG spacer of 43.1 Å gave the second best result which, however, was much lower than bivalent ligand tethered by a 10.8 Å OEG spacer. This finding indicated that there was an unexpected interaction between the second DES binding moiety and the receptor surface. Moreover, a computer calculation study demonstrated that there was not only an end-to-end distance decrease of bivalent ligand due to the folding conformation of the OEG spacer but also a stable hydrophobic- hydrophobic interaction between two DES moieties and the hybrid segment of the spacer.[29] To further understand the structure-activity relationship (SAR) of bivalent estrogen ligand, in the second part bivalent raloxifene (RAL) ligands tethered by OEG spacers of lengths in the range of 4.7-47.7 Å were synthesized and a systematic investigation was carried out. Two bivalent binding modes, either intra- or intermolecular bivalent binding, were hypothesized to explain their different binding abilities (Figure 27a). It was found that 22.7 Å is the critical spacer length to distinguish the intra- from intermolecular bivalent binding on the dimeric ERα LBD. The maximum intermolecular bivalent binding affinity (10% RBA of estradiol (E2)) was achieved when the spacer length is 26.2 Å. Remarkably, it was experimentally confirmed that bivalent ligands tethered by long spacers had weak ER binding affinities caused by ligand shielding due to folding of the OEG spacer. By contrast, those tethered by short spacers exposed their ligands to the receptor more readily. Consequently, they had more unimpeded access to the receptor and stronger ER binding affinities (Figure 27b). Thus, not only the entropic (the folding of OEG spacer) but also the enthalpic (intramolecular interactions) difference between the initial and final conformation state of a bivalent ligand in the aqueous environment does have a major impact on the protein-ligand interaction. Moreover, the absence of hydrogen bond interaction between the linkage group (1,2,3-triazole) of bivalent RAL ligand and the protein residue (Asp351) had an undesirable impact on the enthalpic contribution of the ligand-receptor interaction.[30] To avoid the undesirable decrease in ER binding affinity due to the modification of the ligand, it was necessary to design a bivalent estrogen ligand based on a high-affinity monovalent estrogen ligand with little modification. Therefore, in the third part bivalent cis-OH tamoxifen (OHT) ligands tethered by OEG spacers with lengths in the range of 7.2-43.1 Å were prepared based on the monovalent cis-OHT ligand and evaluated with two ER subtypes to determinate their ER binding affinities. Although their ER binding abilities were decreased by their undesirable conformation in the aqueous environment,[30] two maximum binding affinity peaks at the spacer lengths of 14.4 and 28.8 Å were found (up to 37% and 31% RBA of E2, respectively, Figure 27c), which correspond to the intra- and intermolecular bivalent binding modes, respectively. These results were not only consistent with our previous hypothesis but they also provide an intuitive and precise understanding about the SAR of bivalent estrogen ligands for both ER subtypes, in particular for ERβ. Based on the ER binding affinities of the three bivalent estrogen ligands mentioned above and in previous reports, it has been sufficiently indicated that there are several factors needed to be considered for the bivalent estrogen ligand design. Firstly, an antagonistic estrogen binding moiety, e.g., RAL or cis-OHT, has a better access for the spacer to tether from the exterior of the receptor due to the antagonistic ER-binding mode. By contrast, an agonistic estrogen binding moiety has difficulty in getting such an access unless it has a large substitution at the 17α position of the steroidal structure which, however, can reduce the ER binding affinity of bivalent estrogen ligands. For instance, bivalent ethynyl estradiol (EE2) ligands prepared by LaFrate et al.[124] showed much better ER binding affinity than bivalent E2 ligands which did not have such an large substitute at the 17α position.[120,121] Secondly, the tethered position and the linkage group should be consistent with the environment of the individual bound estrogen ligand. In the case of bivalent trans-DES ligands, the introduction of a hydrophilic linkage group dramatically reduced its ER binding affinity. Conversely, the tertiary amine linkage group of bivalent cis-OHT ligands could maintain the hydrogen bond interaction with the protein residues, and consequently, bivalent cis-OHT ligands had much higher ER binding affinities. Thirdly, the use of a rigid central element as originally suggested by Whitesides et al.[1] can help to minimize the conformational entropy loss and enhance the binding affinity as long as there is no intramolecular interaction between this rigid element and the tethered estrogen binding moiety. A good example was demonstrated by bivalent estrogen ligands tethered by rigid DNA spacers.[198] In contrast, in the case of flexible spacers, it was found that there were intramolecular hydrophobic interactions between the biphenyl segment of the spacer and the tethered trans-DES moiety which could significantly reduce the ER binding affinity.[29] Finally, by using flexible spacers, some structural requirements such as the angle of ligand presentation and spacer length can be readily provided but not by rigid spacers. The flexibility of polyether spacers, however, also increased the structural uncertainty of the ligand due to its folded conformation and the hydrophobic- hydrophobic interaction of its tethered estrogen moieties.[30] In conclusion, achieving high-affinity bivalent binding to the dimeric ER LBD is a daunting challenge. In this thesis, the SAR of bivalent estrogen ligands tethered by lengths of flexible spacers has been established. Two bivalent ER binding modes, intra- and intermolecular, that are essential for the design of high- affinity bivalent estrogen ligand, have been proposed and confirmed based on two series of bivalent estrogen ligands, respectively. These results sufficiently indicate that the achievement of a bivalent binding to the ER dimer cannot simply be dissolved by a structure-based drug design, e.g., choosing a spacer to span the distance between two LBDs. Thus, a systemic understanding about the binding behavior of the bivalent ligands, in particular regarding the conformation of bivalent ligands in the aqueous environment, the intramolecular interaction caused by either the hydrophilic or hydrophobic parts of the bivalent ligand, and the character of the binding moiety, needs to be considered. Additionally, in the case of the ER, further investigation of intramolecular bivalent binding is warranted. Bivalent estrogen ligands tethered by flexible spacers of short length (approximately 10-14 Å) provide a new opportunity for the design of a high-affinity inhibitor of the ER-Coactivator interaction.
