Der systemische Lupus erythematodes ist eine Autoimmunerkrankung mit nachweislichen Dysfunktionen in verschiedenen Kompartimenten des Immunsystems aber weitgehend unklarer Aetiologie. Eine Beteiligung bestimmter Autoantigene ist wahrscheinlich. Die Detektion autoantigenspezifischer Lymphozyten war bislang jedoch technisch schwierig. In dieser Arbeit wurde deshalb ein Verfahren entwickelt, mit dem autoantigenspezifische T- und B-Zellen anhand ihrer Proliferation erfasst und im Anschluss funktionell oder phaenotypisch genauer charakterisiert werden koennen. Im ersten Teil wurde die Technik der Proliferationsmessung mittels CFSE fuer den Nachweis antigenspezifischer Lymphozyten etabliert. CFSE-markierte PBMC wurden dazu mit dem Impfantigen Tetanustoxoid stimuliert und bezueglich der Proliferation von CD4+-, CD8+- und CD19+-Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Es konnten hohe Frequenzen proliferierter B-Zellen nachgewiesen werden, die durch die Faerbung zusaetzlicher Oberflaechenmarker weiter charakterisiert wurden. Dabei zeigte ein Teil der Zellen den fuer Plasmablasten typischen Phaenotypus CD27++/CD20-. Eine kleine Zahl der proliferierten Zellen exprimierte sogar das Plasmazell- typische CD138. Beide Zellarten waren durch tetanustoxoidreaktive in vitro Differenzierung entstanden. Antigenspezifisch proliferierte Th-Zellen wurden bezueglich ihrer Zytokinsekretion durchflusszytometrisch auf Einzelzellebene analysiert. In graeserpollenstimulierten Zellen eines Allergikers und einer Kontrollperson zeigten sich dabei deutliche Unterschiede in der IL-4- und IL-13-Produktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Proliferationsmessung zur Detektion autoantigenspezifisch proliferierter T- und B-Zellen bei SLE- Patienten und gesunden Spendern eingesetzt. Dabei zeigte sich bei 6 von 14 analysierten Patienten, aber auch bei 5 von 10 Gesunden eine relevante nukleosomenreaktive Th-Zellproliferation. Auch B-Zellen proliferierten in beiden Gruppen (bei 2 von 14 Patienten und bei 2 von 10 Gesunden). Nach Stimulation mit dem SmD1-83-119-Peptid reagierten in der Gruppe der Gesunden 2 von 9 mit deutlicher Th- und 3 von 9 mit B-Zellproliferation. In einer Gruppe von 9 SLE-Patienten waren hingegen nur schwache Reaktionen nachweisbar. In dieser Arbeit konnten erstmals autoantigenspezifisch proliferierte Th- und B-Zellen nachgewiesen werden. Interessanterweise fanden sich diese bei Gesunden wie bei SLE-Patienten. Die hier etablierte Methode der weiteren Charakterisierung der proliferierten Zellen, koennte in vielen Bereichen der Immunologie Anwendung finden und auch zur Aufklaerung der pathogenetischen Relevanz autoreaktiver Lymphozyten bei Patienten und Gesunden beitragen.
Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease showing multiple dysfunctions within the immune system. But still the etiology remains unclear. Presumably certain autoantigens play a pivotal role. The detection of autoreactive lymphocytes, however, has been technically difficult, so far. Thus, our aim was to develope a technique allowing the detection of autoreactive T and B cells according to autoantigen-specific proliferation and in a second step providing further functional and phenotypical characterisation. In the first part we developed a strategy to simultaneously analyse CD4+-, CD8+- and CD19+- cell proliferation after antigenic provocation of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). We therefore performed a CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester)-based cytometric assay. In response to the recall antigen tetanus toxoid proliferating T cells as well as proliferating B cells were detectable in high frequencies. The further characterisation of tetanus reactive B cells showed a typical plasmablast phenotype with CD27 high and CD20 low expression in more than 80 percent of the proliferated cells. A small number even expressed CD138 at cell surface, which is a differentiation marker of plasma cells. Interestingly, both cell types had developed in vitro from PBMC with tetanus toxoid as the only stimulus. Antigen-specific proliferated CD4+ T helper cells were functionally characterised on single cell level in respect to their cytokine secretion pattern after polyclonal restimulation. The comparison of the cytokine profile of grass pollen reactive proliferated T helper cells showed differences in IL-4 and IL-13 secretion between an atopic donor and a healthy individual In the second part the method was adopted to detect autoreactive T and B cells in SLE patients and healthy donors. Nucleosome-reactive proliferated T helper cells were found in 6 out of 14 patients and in 5 out of ten healthy persons, respectively. Also nucleosome-reactive proliferated B cells could be detected in both groups (2 out of 14 patients and 2 out of 10 healthy donors). After stimulation with SmD1-83-119-peptide 2 of 9 healthy donors clearly showed proliferation of T helper cells and 3 showed B cell proliferation. Within the SLE patients, however, only weak responses were detectable. Here, for the first time, autoantigen-specific proliferated lymphocytes could be differentiated into T helper and B cells. Interestingly they were found as well in SLE patients as in healthy donors. The newly developed strategy of further characterisation could be applied to learn more about there pathogenic relevance of these cells. Furthermore this method based on CFSE offers various application facilities in immunologic research.
