The primary focus of the study was evaluation of the effects of physical (gas phase) and biochemical (medium compounds) variables on in vitro maturation (IVM) and in vitro fertilization (IVF) of oocytes from common marmoset (Callithrix jacchus), with the impact on embryo production and quality. Cumulus oocyte complexes (COC’s) were collected from mainly small and medium sized antral follicles of naturally cycling young adult females in mid to late follicular phase. The COC’s were matured in vitro under a range of conditions, and fertilized in vitro using naturally ejaculated washed sperm. Embryo development was carried out under standardized conditions following the protocol established by Gilchrist et al. (1997). As a control, IVF and embryo culture of in vivo matured oocytes was performed. The study focused primarily on optimization of IVM conditions for marmoset monkey oocytes and evaluation of the effect of factors which have been shown to be important for other species. Epidermal growth factor (EGF) was tested using a fixed concentration (10 ng/ml), in the presence of one or the other of 2 gonadotrophin concentrations during IVM. Human follicle-stimulating hormone (hFSH) and human chorionic gonadotrophin (hCG) were used in 1:1 ratio in either low (1 IU/ml) or high (10 IU/ml) concentration. The control groups consisted of the 2 gonadotrophin concentrations without EGF. The effects of EGF were highly dependant on concentration of gonadotrophins. EGF had a negative effect on oocytes in the presence of low gonadotrophins (increased oocyte degeneration and decreased first cleavage rate), but contrastingly, partially protected oocytes from the negative effects of high gonadotrophins. These observed negative effects of EGF may suggest an overdose of this growth factor under the conditions tested. Alternatively, it can be related to steroidogenesis- inhibiting action of EGF or result from its specific action on COC’s from small antral follicles. Further, the effect of 17ß-estradiol (E2) in IVM medium was evaluated. Three concentrations 0.1, 1 and 10 μg/ml E2 were compared with control where no E2 was added. A positive dose-dependent effect of E2 on cumulus expansion was observed. Addition of E2 significantly improved oocyte maturation (MII), and cleavage rates. The highest rates were observed in the presence of 0.1 μg/ml E2, whereas 10 μg/ml displayed features of overdose. This was evidenced by: a significantly higher degeneration rate, lower rate of apparently normal spindle shape in arrested oocytes and absence of embryo progression. Finally, the physical parameter, O2 concentration in a gas phase of incubator, during IVM (20 or 8% O2) and IVF (20 or 5%) was investigated in different combinations. High (20%) O2 was shown to be optimal for IVM, due to its positive effect on cumulus expansion, oocyte maturation, and embryo development, while low (5%) O2 was to be preferred over 20% for IVF, based on a trend for better embryo morphology and rates of progression. In summary, optimised environment for embryo production from immature oocytes included following conditions: IVM medium included 1 IU/ml hFSH, 1 IU/ml hCG, 0.1 μg/ml E2 and no EGF. Optimal gas conditions were: 5% CO2 in air for IVM and 5% O2, 5% CO2 and 90% N2 for IVF. Under these conditions about 53% of the recovered immature oocytes completed maturation in vitro (i.e. about 22 MII oocyte per animal), 61% of these fertilized and 57% cleaved. Fourteen percent of the cleaved embryos reached morula and 7% initiated blastocoele formation. As a control for IVM studies, in vivo matured oocytes were produced by timed injection of 75 IU hCG applied to naturally cycling young females. The purpose was firstly to determine the innate quality of the in vivo matured oocytes from dominant follicles in our population of marmosets, without the complication of individually variable response to ovarian stimulation. Secondly the capacity of the standard IVF and embryo media used in the IVM experiments to support development to blastocyst was verified. The mean number of good quality, fully expanded COC’s aspirated from preovulatory follicles was 1.4 per animal (varying from 0 to 3). In total 17 mature oocytes were collected in 13 cycles; 59% of these fertilized, and of these 100% cleaved. Of the cleaved embryos 60% progressed to compacted morula between embryo days 6 and 7, and 30% - to early blastocyst. This result is very close to those commonly seen with human IVF, except much longer period of marmoset embryo progression towards blastocyst compared with human (9 vs. 5 days respectively). The difference in the results obtained for in vivo vs. in vitro matured oocytes, is likely to be provided by a combination of the oocyte origin (dominant/non-dominant follicles) and of the adverse effects of the IVM. Finally, because of the high degree of individual variability observed during the study, the last part of the dissertation work was focused on the analysis of factors, determining oocyte quality in marmoset monkey. First, analysis of physiological (internal) factors, predicting embryo production both in vivo and in vitro has been carried out, using birth history in marmoset colony, hormone measurements data and culture outcome. Briefly, higher embryo production was observed by younger animals with moderate body weight (370-470 g), lower blood progesterone level, and originated from mothers, who had lower litter size and shorter interbirth intervals as an indicator of normal ovarian function. Second, impact of the external factors on reproductive function was shown in terms of retrospective analysis of in vivo treatment of female marmosets with broad-spectrum fluoroquinolone antibiotic enrofloxacin. This antibiotic is used as a routine treatment against haemolytic E.coli, the major causal agent of the recurring problem of bloody diarrhea in our colony. To date, there is no published information on the possible effects of this antibiotic on the female reproductive function, in particular folliculo- and gametogenesis. The present study shows that enrofloxacin impairs follicle development, affecting primary/secondary follicles, presumably by inhibition of cumulus cell cleavage. The effect of enrofloxacin became most apparent about 7 weeks post treatment and was evident by: low number of COC’s recovered and drastically reduced fertilization and cleavage. In conclusion, the present dissertation work demonstrates an improved functioning system for in vitro embryo production from both in vivo and in vitro matured oocytes of marmoset monkey. It further emphasises differences in the initial oocyte quality and their effect on experimental outcome, indicating necessity of a thorough and systematic improvement in the husbandry in order to maintain experimental animals’ health to encourage more effective use of marmoset monkey in reproductive research.
Schwerpunkt dieser Studie war die Evaluierung von Einflüssen von physikalischen (Gasphase) und biochemischen (Mediumzusätze) Faktoren auf in vitro Reifung (IVM) und in vitro Befruchtung (IVF) der Eizellen von Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), mit Auswirkung auf Embryoproduktion und -qualität. Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) wurden aus meist kleinen und mittelgroßen Graaf’schen Follikeln von jungen erwachsenen Weibchen mit natürlichem Zyklus in der mittleren bis späten follikulären Phase gewonnen. Die KOK wurden in vitro unter einer Reihe von unterschiedlichen Bedingungen gereift und in vitro mit natürlich ejakulierten, gewaschenen Spermien befruchtet. Die Embryonenentwicklung wurde unter standardisierten Bedingungen durchgeführt, den Protokollen von Gilchrist et al (2007) folgend. Als Kontrolle wurde IVF und Embryonenkultur von in vivo gereifen Oozyten durchgeführt. Die Studie konzentrierte sich hauptsächlich auf Optimierung von IVM-Bedingungen für Weißbüschelaffenoozyten sowie Beurteilung des Einflusses von Faktoren, die als wichtig bei anderen Spezies beschrieben sind. Der Einfluss von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) in einer Standardkonzentration von 10 ng/ml wurde mit je einer der beiden Gonadotropinkonzentrationen während der IVM getestet. Humanes Follikelstimulierendes Hormon (hFSH) und humanes Choriongonadotropin (hCG) wurden im Verhältnis 1:1 entweder in niedriger (1 IU/ml) oder hoher (10 IU/ml) Konzentration anwendet. Als Kontrolle dienten die zwei Gruppen mit den beiden Konzentrationen von Gonadotrophin ohne EGF. Die Effekte des EGF hingen stark von den Konzentrationen der Gonadotropine ab. Zusammen mit niedriger Gonadotropinkonzentration hatte EGF einen negativen Effekt auf die Eizellen (erhöhte Degeneration und verminderte Rate der ersten Furchung); dagegen schützte EGF teilweise die Oozyten bei hoher Gonadotropinkonzentration. Diese beobachteten negativen Effekte von EGF können eine Überdosierung des Wachsturmfaktors unter den getesteten Bedingungen bedeuten. Andererseits können diese auch mit der Steroid-inhibierenden Wirkung des EGF im Zusammenhang stehen oder sind Ergebnis spezifischer Einwirkung von EGF auf KOK kleiner Graaf’scher Follikel. Weiter, der Einfluss durch 17ß- Oestradiol (E2)-Zugabe ins IVM-Medium wurde evaluiert. Dabei wurden drei Konzentrationen von E2 von 0.1, 1 und 10 μg/ml mit einer Kontrollgruppe (kein E2) verglichen. Ein positiver, dosis-abhängender Effekt von E2 auf die Kumulusexpansion wurde beobachtet. Die E2-Zugabe verbesserte die Eizellenreifung (MII) und Embryofurchung mit den höchsten Raten unter 0.1 μg/ml E2. Bei einer Konzentration von 10 μg/ml zeigten sich Überdosierungsanzeichen in Form von signifikant höherer Degenerationsrate, niedrigerer Rate an anscheinend normalen Spindelformen in gestoppten Eizellen und fehlender Embryoprogression. Schließlich wurde ein physikalische Parameter, die O2-Konzentration in der Gasatmosphäre des Brutschranks, während IVM (20 oder 8% O2) und IVF (20 oder 5%) in verschiedenen Kombinationen untersucht. Die höhere (20%) O2 -Konzentration ist danach optimal für IVM dank des positiven Einflusses auf die Kumulusexpansion, Eizellenreifung und Embryoentwicklung, während für IVF die niedrigere (5%) O2 -Konzentration der höheren (20%) O2 -Konzentration überlegen war, was anhand eines Trends zur besseren Embryomorphologie und Progressionsrate zu sehen war. Zusammengefasst, optimierte Umgebung zur Embryoproduktion aus ungereiften Oozyten bestand aus folgenden Bedingungen: IVM Medium beinhaltend 1 IU/ml hFSH, 1 IU/ml hCG, 0.1 μg/ml E2 und kein EGF. Optimale Gasgemischbedingungen waren: 5% CO2 in normaler Luft für IVM und 5% O2, 5% CO2 und 90% N2 für IVF. Diese Bedingungen ermöglichten komplette in vitro Reifung in 53% der gewonnenen, ungereiften Oozyten (ca. 22 MII Oozyten pro Tier). Einundsechzig Prozent davon wurden befruchtet und 57% teilten sich. Vierzehn Prozent der Embryonen erreichten das Morula-Stadium, und 7% entwickelten sich weiter ins Blastozytenstadium. Als Kontrolle zu den IVM Versuchen wurden in vivo gereifte Oozyten herangezogen, deren Reifung durch zeitlich abgepasste Injektion von 75 IU hCG an junge Weibchen mit natürlichem Zyklus induziert wurden. Das Ziel war, erstens, die natürliche Qualität von in vivo gereiften Oozyten aus den dominanten Follikeln in unserer Weißbüschelaffenpopulation zu bestimmen, ohne den Störfaktor der individuellen variablen Rückmeldung auf die ovarielle Stiumulation. Zweitens wurde die Fähigkeit von in IVM Versuchen benutzten IVF- und Embryostandardmedien die Embryoentwicklung zum Blastozystenstadium zu unterstützen, verifiziert. Durchschnittlich wurden 1,4 voll-expandierte KOK von guter Qualität pro Tier gesehen, entwickelt aus aspirierten Tertiärfollikeln (Variation von 0 bis 3 KOK/Tier). Insgesamt wurden 17 reife Eizellen aus 13 Zyklen gewonnen, 59% davon befruchtet, und alle befruchtete haben sich geteilt. Sechzig Prozent aller Embryonen entwickelten sich in 6 bis 7 Embryonaltagen bis zum Morulastadium und 30% bis zum frühen Blastozystenstadium. Dieses Ergebnis ist sehr ähnlich zu denen von humaner IVF mit Ausnahme des viel längeren Zeitraums der Weiterentwicklung von Embryonen des Weißbüschelaffen zum Blastozystenstadium im Vergleich zu humaner Embryonen (9 vs. 5 Tage entsprechend). Der Unterschied zwischen in vivo und in vitro Ergebnissen entsteht wahrscheinlich durch die Kombination der Faktoren der Oozytenquelle (dominante/ nicht dominante Follikel) und Nachteilen der IVM. Schließlich, infolge des hohen Grades von individueller Variabilität, die während der Studie beobachtet wurde, handelt der letzte Teil der Dissertationsarbeit von Analysen von Faktoren, die die Oozytenqualität in Weißbüschelaffen beeinflussen. Zuerst wurde die Analyse von physiologischen (inneren) Faktoren, welche die Embryoproduktion in vivo sowie in vitro voraussagen können, durchgeführt. Dafür wurden Geburtenbücher und -protokolle unserer Affenkolonie herangezogen, sowie Hormonwerte und Ergebnisse der in vitro Versuche. In Kürze, eine höhere Embryoproduktion wurde bei jüngeren Tieren mit moderatem Gewicht (370-470 g) und niedrigerem Blut- Progesteron Spiegel beobachtet, die von Mütter stammten, welche kleinere Wurfgrößen und kürzere Zeitabstande zwischen zwei Geburten hatten, die als Indikatoren für normale Ovarfunktion gelten. Weiter wurde der Einfluss von externen Faktoren auf die reproduktive Funktion aufgezeigt durch retrospektive Analyse von in vivo Behandlungen von weiblichen Weißbüschelaffen mit einem Breitbandantibiotikum Enrofloxacin. Dieses Antibiotikum wird routinemäßig zur Behandlung gegen E.coli, den Hauptverursacher von rezidivierenden blutigen Durchfällen in unsere Kolonie, verwendet. Bis jetzt wurde nach unserer Kenntnis noch nie über mögliche Effekte des Antibiotikums auf das weibliche Reproduktionssystem, in Besonderem auf die Follikulo- und Gametogenese publiziert. Die vorliegende Studie zeigt, dass Enrofloxacin die Follikelentwicklung unterdrückt, wobei es auf Primär-/Sekundärfollikel einwirkt, vermutlich durch die Unterdrückung der Kumuluszellteilung. Der Enrofloxacin¬-Einfluss wurde am deutlichsten ca. 7 Wochen nach der Behandlung und zeigte sich durch niedrige Anzahlen an gewonnen KOK und drastisch reduzierten Befruchtungs- und Furchungsraten. Zusammengefasst zeigt die vorliegende Dissertationsarbeit ein optimiertes, funktionierendes System zur in vitro Embryoproduktion aus in vivo sowie in vitro gereiften Oozyten von Weißbüschelaffen. Dies hebt die Unterschiede in initialer Oozytenqualität und deren Einfluss auf Erfolg des Versuches hervor, hinweisend auf die Notwendigkeit durch sorgfältige Haltung die Gesundheit der Versuchstiere zu erhalten und zu ermutigen die Weißbüschelaffen effektiver in der reproduktiven Forschung einzusetzen.
