dc.contributor.author
Tkachenko, Olena
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:34:09Z
dc.date.available
2012-05-15T08:15:51.016Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10663
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14861
dc.description
Content SUMMARY 9 ZUSAMMENFASSUNG 12 CONTENT 15 1\. INTRODUCTION 19 1.1.
Marmoset as a model animal for reproductive studies 19 1.1.1. Taxonomy and
morphology of the common marmoset 19 1.1.2. Habitat in the wild and captive
conditions 20 1.1.3. Lifespan and body size and in the wild and captivity 21
1.1.4. Diet in the wild and in captivity 21 1.1.5. Social organization and
reproduction 22 1.1.6. Use in biomedical research 24 1.2. Current achievements
in in vitro oocyte and embryo studies in marmosets 26 1.3. Aims 28 2\. GENERAL
MATERIALS AND METHODS 29 2.1. Materials 29 2.1.1. Animals 29 2.1.2. Equipment
30 2.1.2.1. Devices 30 2.1.2.2. Laboratory materials 31 2.1.2.3. Mouth pipette
32 2.1.3. Chemicals 33 2.1.3.1. Chemicals used for culture, sperm preparation,
immunocyto- and histochemistry and histology 33 2.1.3.2. Chemicals used for
hormone assays 35 2.2. Methods 36 2.2.1. Cycle monitoring and luteolysis
induction 36 2.2.2. Narcosis 36 2.2.3. Hormone measurements 37 2.2.3.1. Blood
collection 37 2.2.3.2. P4 37 2.2.3.3. Total estrogens 38 2.2.3.4. Androgens 38
2.2.3.5. Triglycerides 39 2.2.4. Oocyte IVM/IVF and embryo culture procedures
39 2.2.4.1. Culture media preparation 39 2.2.4.2. Dissection and culture plate
preparation 43 2.2.4.3. Ovary collection, dissection, COCs’ recovery and IVM
43 2.2.4.4. Oocyte recovery after hormonal stimulation 44 2.2.4.5. IVF 44
2.2.4.6. Embryo culture 45 2.2.5. Immunocytochemical procedures for oocytes
and embryos 46 2.2.5.1. Fixation 46 2.2.5.2. Staining 48 2.2.6. Ovary
histology 49 2.2.7. Procedures with sperm 49 2.2.7.1. Sperm collection 49
2.2.7.2. Sperm sample preparation 50 2.2.7.3. Motility evaluation 52 2.2.7.4.
Sperm cell count 52 2.2.7.5. Acrosome staining 52 2.2.7.6. Live-dead sperm
staining with Eosin-Nigrosin 53 2.2.8. Evaluation of results 53 2.2.8.1.
Oocytes and embryos 53 2.2.8.2. Sperm 55 2.2.8.3. Ovarian histology 56
2.2.8.4. Statistics 56 3\. EXPERIMENTS 57 3.1. Pre-experiment. Addition of
antioxidants in IVM and IVF medium 57 3.1.1. Introduction 57 3.1.2. Materials
and methods 59 3.1.2.1. Animals 59 3.1.2.2. Media and gas environment 59
3.1.2.3. Experimental design 59 3.1.3. Results 61 3.1.3.1. Experiment 1 61
3.1.3.2. Experiment 2 62 3.1.3.3. Experiment 3 64 3.1.4. Discussion 66 3.2.
Effects of epidermal growth factor (EGF) on marmoset oocyte IVM, IVF and
embryo development are altered by gonadotrophin concentration during oocyte
maturation 69 3.2.1. Introduction 69 3.2.2. Materials and methods 71 3.2.2.1.
Animals 71 3.2.2.2. Media and gas environment 71 3.2.2.3. Experimental design
71 3.2.3. Results 73 3.2.3.1. Cumulus expansion 73 3.2.3.2. Oocyte maturation
73 3.2.3.3. Degeneration 75 3.2.3.4. Fertilization 75 3.2.3.5. Cleavage 75
3.2.3.6. Embryo progression on day 2 and 3 76 3.2.3.7. Evaluation of
microtubular cytoskeleton of oocytes/zygotes which failed to cleave, and
embryo quality 78 3.2.4. Discussion 81 3.3. Effect of estradiol (E2) dose
during IVM on marmoset oocyte maturation, fertilization and embryo development
87 3.3.1. Introduction 87 3.3.2. Materials and methods 90 3.3.2.1. Animals 90
3.3.2.2. Media and gas environment 90 3.3.2.3. Experimental design. Main
experiment 91 2.2.3.4. Measurement of E2 concentration in medium drops under
oil (performed in collaboration with M. Heistermann) 91 3.3.3. Results 93
3.3.3.1. Cumulus cell response. Expansion 93 3.3.3.2. Oocyte responses 94
3.3.3.2.1. Maturation 94 3.3.3.2.2. Degeneration 94 3.3.3.2.3. Fertilization
and cleavage 94 3.3.3.2.4. Embryo progression 96 3.3.3.2.5. Meiotic spindles
97 3.3.3.2.6. E2 absorption by mineral oil. Actual E2 content in IVM drops 98
3.3.4. Discussion 100 3.4. Effects of oxygen (O2) concentration during IVM and
IVF of marmoset monkey oocytes on subsequent development 104 3.4.1.
Introduction 104 3.4.2. Materials and Methods 107 3.4.2.1. Animals 107
3.4.2.2. Media and gas environment 107 3.4.2.3. Experimental design 107 3.4.3
Results 109 3.4.3.1. Cumulus expansion 109 3.4.3.2 Maturation and degeneration
109 3.4.3.3. Spindles 110 3.4.3.4. Fertilization 111 3.4.3.5 Cleavage 112
3.4.3.6 Embryo progression and embryo quality 112 3.4.4. Discussion 115 3.5.
Gonadotrophin stimulation of marmoset oocyte maturation in vivo followed by
fertilization and embryo development in vitro 119 3.5.1. Introduction 119
3.5.2. Materials and methods 122 3.5.2.1. Animals 122 3.5.2.2. Hormonal
stimulation 122 3.5.2.3. Media and gas environment 123 3.5.3 Results and
Interpretation 124 3.5.3.1. Stimulation Protocol 1 124 3.5.3.2. Stimulation
Protocol 2 128 3.5.3.3. Stimulation Protocol 3 129 3.5.3.4. hCG triggering -
timed in vivo maturation of natural cycle oocytes 132 3.5.3.5. IVM group 134
3.5.4. Discussion 138 3.6. Oocyte quality 142 3.6.1. Animal variability 143
3.6.1.1 Introduction 143 3.6.1.2 Materials and Methods 144 3.6.1.3 Results 145
3.6.1.3.1. Colony data analysis 145 3.6.1.3.1.1. Relation of body weight and
age to litter size 145 3.6.1.3.1.2. Interbirth interval as an index of quality
of reproductive function 146 3.6.1.3.1.3. Stillbirth as an indicator of
dysfunctional reproduction 149 3.6.1.3.2. Analysis of experimental animals and
the in vitro results generated from them 149 3.6.1.3.2.1. Number of recovered
immature COC’s 149 3.6.1.3.2.2. Oocyte degeneration 152 3.6.1.3.2.3. Embryo
production 154 3.6.1.3.2.4. Hormone levels as indicators of ovary state and
reproductive function 156 3.6.1.4 Discussion 159 3.6.2. In vivo enrofloxacin
treatment of marmoset affects oocyte quality 163 3.6.2.1 Introduction 163
3.6.2.2 Materials and methods 165 3.6.2.2.1. Animals and experimental design
165 3.6.2.2.2. Media and gas environment 166 3.6.2.3 Results 167 3.6.2.3.1.
COCs’ harvest and cumulus expansion after IVM 167 3.6.2.3.2. Oocyte maturation
and degeneration 168 3.6.2.3.3. Fertilization 168 3.6.2.3.4. Cleavage 169
3.6.2.3.5. Spindle shape 169 3.6.2.3.6. Ovarian histology and hormone data 173
3.6.2.3.7. Follicle atresia 175 3.6.2.4 Discussion 177 4\. GENERAL OVERVIEW
AND DISCUSSION; VIEWS TO FUTURE 180 5\. CONCLUSIONS 186 6\. REFERENCES 188 7\.
ATTACHMENT 215 7.1. Abbreviations 215 7.1.1. General abbreviations 215 7.1.2.
Experimental groups abbreviations 219 7.2. Figure index 220 7.3. Table index
226 7.4. Formula index 229 7.5. Computer programms applied 230 7.6.
Manufacturer index 231 7.7. List of all animals used 233 7.8. Additional
tables 235 Acknowledgements 240 Publications 241 Curriculum vitae 242
dc.description.abstract
The primary focus of the study was evaluation of the effects of physical (gas
phase) and biochemical (medium compounds) variables on in vitro maturation
(IVM) and in vitro fertilization (IVF) of oocytes from common marmoset
(Callithrix jacchus), with the impact on embryo production and quality.
Cumulus oocyte complexes (COC’s) were collected from mainly small and medium
sized antral follicles of naturally cycling young adult females in mid to late
follicular phase. The COC’s were matured in vitro under a range of conditions,
and fertilized in vitro using naturally ejaculated washed sperm. Embryo
development was carried out under standardized conditions following the
protocol established by Gilchrist et al. (1997). As a control, IVF and embryo
culture of in vivo matured oocytes was performed. The study focused primarily
on optimization of IVM conditions for marmoset monkey oocytes and evaluation
of the effect of factors which have been shown to be important for other
species. Epidermal growth factor (EGF) was tested using a fixed concentration
(10 ng/ml), in the presence of one or the other of 2 gonadotrophin
concentrations during IVM. Human follicle-stimulating hormone (hFSH) and human
chorionic gonadotrophin (hCG) were used in 1:1 ratio in either low (1 IU/ml)
or high (10 IU/ml) concentration. The control groups consisted of the 2
gonadotrophin concentrations without EGF. The effects of EGF were highly
dependant on concentration of gonadotrophins. EGF had a negative effect on
oocytes in the presence of low gonadotrophins (increased oocyte degeneration
and decreased first cleavage rate), but contrastingly, partially protected
oocytes from the negative effects of high gonadotrophins. These observed
negative effects of EGF may suggest an overdose of this growth factor under
the conditions tested. Alternatively, it can be related to steroidogenesis-
inhibiting action of EGF or result from its specific action on COC’s from
small antral follicles. Further, the effect of 17ß-estradiol (E2) in IVM
medium was evaluated. Three concentrations 0.1, 1 and 10 μg/ml E2 were
compared with control where no E2 was added. A positive dose-dependent effect
of E2 on cumulus expansion was observed. Addition of E2 significantly improved
oocyte maturation (MII), and cleavage rates. The highest rates were observed
in the presence of 0.1 μg/ml E2, whereas 10 μg/ml displayed features of
overdose. This was evidenced by: a significantly higher degeneration rate,
lower rate of apparently normal spindle shape in arrested oocytes and absence
of embryo progression. Finally, the physical parameter, O2 concentration in a
gas phase of incubator, during IVM (20 or 8% O2) and IVF (20 or 5%) was
investigated in different combinations. High (20%) O2 was shown to be optimal
for IVM, due to its positive effect on cumulus expansion, oocyte maturation,
and embryo development, while low (5%) O2 was to be preferred over 20% for
IVF, based on a trend for better embryo morphology and rates of progression.
In summary, optimised environment for embryo production from immature oocytes
included following conditions: IVM medium included 1 IU/ml hFSH, 1 IU/ml hCG,
0.1 μg/ml E2 and no EGF. Optimal gas conditions were: 5% CO2 in air for IVM
and 5% O2, 5% CO2 and 90% N2 for IVF. Under these conditions about 53% of the
recovered immature oocytes completed maturation in vitro (i.e. about 22 MII
oocyte per animal), 61% of these fertilized and 57% cleaved. Fourteen percent
of the cleaved embryos reached morula and 7% initiated blastocoele formation.
As a control for IVM studies, in vivo matured oocytes were produced by timed
injection of 75 IU hCG applied to naturally cycling young females. The purpose
was firstly to determine the innate quality of the in vivo matured oocytes
from dominant follicles in our population of marmosets, without the
complication of individually variable response to ovarian stimulation.
Secondly the capacity of the standard IVF and embryo media used in the IVM
experiments to support development to blastocyst was verified. The mean number
of good quality, fully expanded COC’s aspirated from preovulatory follicles
was 1.4 per animal (varying from 0 to 3). In total 17 mature oocytes were
collected in 13 cycles; 59% of these fertilized, and of these 100% cleaved. Of
the cleaved embryos 60% progressed to compacted morula between embryo days 6
and 7, and 30% - to early blastocyst. This result is very close to those
commonly seen with human IVF, except much longer period of marmoset embryo
progression towards blastocyst compared with human (9 vs. 5 days
respectively). The difference in the results obtained for in vivo vs. in vitro
matured oocytes, is likely to be provided by a combination of the oocyte
origin (dominant/non-dominant follicles) and of the adverse effects of the
IVM. Finally, because of the high degree of individual variability observed
during the study, the last part of the dissertation work was focused on the
analysis of factors, determining oocyte quality in marmoset monkey. First,
analysis of physiological (internal) factors, predicting embryo production
both in vivo and in vitro has been carried out, using birth history in
marmoset colony, hormone measurements data and culture outcome. Briefly,
higher embryo production was observed by younger animals with moderate body
weight (370-470 g), lower blood progesterone level, and originated from
mothers, who had lower litter size and shorter interbirth intervals as an
indicator of normal ovarian function. Second, impact of the external factors
on reproductive function was shown in terms of retrospective analysis of in
vivo treatment of female marmosets with broad-spectrum fluoroquinolone
antibiotic enrofloxacin. This antibiotic is used as a routine treatment
against haemolytic E.coli, the major causal agent of the recurring problem of
bloody diarrhea in our colony. To date, there is no published information on
the possible effects of this antibiotic on the female reproductive function,
in particular folliculo- and gametogenesis. The present study shows that
enrofloxacin impairs follicle development, affecting primary/secondary
follicles, presumably by inhibition of cumulus cell cleavage. The effect of
enrofloxacin became most apparent about 7 weeks post treatment and was evident
by: low number of COC’s recovered and drastically reduced fertilization and
cleavage. In conclusion, the present dissertation work demonstrates an
improved functioning system for in vitro embryo production from both in vivo
and in vitro matured oocytes of marmoset monkey. It further emphasises
differences in the initial oocyte quality and their effect on experimental
outcome, indicating necessity of a thorough and systematic improvement in the
husbandry in order to maintain experimental animals’ health to encourage more
effective use of marmoset monkey in reproductive research.
de
dc.description.abstract
Schwerpunkt dieser Studie war die Evaluierung von Einflüssen von
physikalischen (Gasphase) und biochemischen (Mediumzusätze) Faktoren auf in
vitro Reifung (IVM) und in vitro Befruchtung (IVF) der Eizellen von
Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), mit Auswirkung auf Embryoproduktion und
-qualität. Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) wurden aus meist kleinen und
mittelgroßen Graaf’schen Follikeln von jungen erwachsenen Weibchen mit
natürlichem Zyklus in der mittleren bis späten follikulären Phase gewonnen.
Die KOK wurden in vitro unter einer Reihe von unterschiedlichen Bedingungen
gereift und in vitro mit natürlich ejakulierten, gewaschenen Spermien
befruchtet. Die Embryonenentwicklung wurde unter standardisierten Bedingungen
durchgeführt, den Protokollen von Gilchrist et al (2007) folgend. Als
Kontrolle wurde IVF und Embryonenkultur von in vivo gereifen Oozyten
durchgeführt. Die Studie konzentrierte sich hauptsächlich auf Optimierung von
IVM-Bedingungen für Weißbüschelaffenoozyten sowie Beurteilung des Einflusses
von Faktoren, die als wichtig bei anderen Spezies beschrieben sind. Der
Einfluss von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) in einer Standardkonzentration
von 10 ng/ml wurde mit je einer der beiden Gonadotropinkonzentrationen während
der IVM getestet. Humanes Follikelstimulierendes Hormon (hFSH) und humanes
Choriongonadotropin (hCG) wurden im Verhältnis 1:1 entweder in niedriger (1
IU/ml) oder hoher (10 IU/ml) Konzentration anwendet. Als Kontrolle dienten die
zwei Gruppen mit den beiden Konzentrationen von Gonadotrophin ohne EGF. Die
Effekte des EGF hingen stark von den Konzentrationen der Gonadotropine ab.
Zusammen mit niedriger Gonadotropinkonzentration hatte EGF einen negativen
Effekt auf die Eizellen (erhöhte Degeneration und verminderte Rate der ersten
Furchung); dagegen schützte EGF teilweise die Oozyten bei hoher
Gonadotropinkonzentration. Diese beobachteten negativen Effekte von EGF können
eine Überdosierung des Wachsturmfaktors unter den getesteten Bedingungen
bedeuten. Andererseits können diese auch mit der Steroid-inhibierenden Wirkung
des EGF im Zusammenhang stehen oder sind Ergebnis spezifischer Einwirkung von
EGF auf KOK kleiner Graaf’scher Follikel. Weiter, der Einfluss durch 17ß-
Oestradiol (E2)-Zugabe ins IVM-Medium wurde evaluiert. Dabei wurden drei
Konzentrationen von E2 von 0.1, 1 und 10 μg/ml mit einer Kontrollgruppe (kein
E2) verglichen. Ein positiver, dosis-abhängender Effekt von E2 auf die
Kumulusexpansion wurde beobachtet. Die E2-Zugabe verbesserte die
Eizellenreifung (MII) und Embryofurchung mit den höchsten Raten unter 0.1
μg/ml E2. Bei einer Konzentration von 10 μg/ml zeigten sich
Überdosierungsanzeichen in Form von signifikant höherer Degenerationsrate,
niedrigerer Rate an anscheinend normalen Spindelformen in gestoppten Eizellen
und fehlender Embryoprogression. Schließlich wurde ein physikalische
Parameter, die O2-Konzentration in der Gasatmosphäre des Brutschranks, während
IVM (20 oder 8% O2) und IVF (20 oder 5%) in verschiedenen Kombinationen
untersucht. Die höhere (20%) O2 -Konzentration ist danach optimal für IVM dank
des positiven Einflusses auf die Kumulusexpansion, Eizellenreifung und
Embryoentwicklung, während für IVF die niedrigere (5%) O2 -Konzentration der
höheren (20%) O2 -Konzentration überlegen war, was anhand eines Trends zur
besseren Embryomorphologie und Progressionsrate zu sehen war. Zusammengefasst,
optimierte Umgebung zur Embryoproduktion aus ungereiften Oozyten bestand aus
folgenden Bedingungen: IVM Medium beinhaltend 1 IU/ml hFSH, 1 IU/ml hCG, 0.1
μg/ml E2 und kein EGF. Optimale Gasgemischbedingungen waren: 5% CO2 in
normaler Luft für IVM und 5% O2, 5% CO2 und 90% N2 für IVF. Diese Bedingungen
ermöglichten komplette in vitro Reifung in 53% der gewonnenen, ungereiften
Oozyten (ca. 22 MII Oozyten pro Tier). Einundsechzig Prozent davon wurden
befruchtet und 57% teilten sich. Vierzehn Prozent der Embryonen erreichten das
Morula-Stadium, und 7% entwickelten sich weiter ins Blastozytenstadium. Als
Kontrolle zu den IVM Versuchen wurden in vivo gereifte Oozyten herangezogen,
deren Reifung durch zeitlich abgepasste Injektion von 75 IU hCG an junge
Weibchen mit natürlichem Zyklus induziert wurden. Das Ziel war, erstens, die
natürliche Qualität von in vivo gereiften Oozyten aus den dominanten Follikeln
in unserer Weißbüschelaffenpopulation zu bestimmen, ohne den Störfaktor der
individuellen variablen Rückmeldung auf die ovarielle Stiumulation. Zweitens
wurde die Fähigkeit von in IVM Versuchen benutzten IVF- und
Embryostandardmedien die Embryoentwicklung zum Blastozystenstadium zu
unterstützen, verifiziert. Durchschnittlich wurden 1,4 voll-expandierte KOK
von guter Qualität pro Tier gesehen, entwickelt aus aspirierten
Tertiärfollikeln (Variation von 0 bis 3 KOK/Tier). Insgesamt wurden 17 reife
Eizellen aus 13 Zyklen gewonnen, 59% davon befruchtet, und alle befruchtete
haben sich geteilt. Sechzig Prozent aller Embryonen entwickelten sich in 6 bis
7 Embryonaltagen bis zum Morulastadium und 30% bis zum frühen
Blastozystenstadium. Dieses Ergebnis ist sehr ähnlich zu denen von humaner IVF
mit Ausnahme des viel längeren Zeitraums der Weiterentwicklung von Embryonen
des Weißbüschelaffen zum Blastozystenstadium im Vergleich zu humaner Embryonen
(9 vs. 5 Tage entsprechend). Der Unterschied zwischen in vivo und in vitro
Ergebnissen entsteht wahrscheinlich durch die Kombination der Faktoren der
Oozytenquelle (dominante/ nicht dominante Follikel) und Nachteilen der IVM.
Schließlich, infolge des hohen Grades von individueller Variabilität, die
während der Studie beobachtet wurde, handelt der letzte Teil der
Dissertationsarbeit von Analysen von Faktoren, die die Oozytenqualität in
Weißbüschelaffen beeinflussen. Zuerst wurde die Analyse von physiologischen
(inneren) Faktoren, welche die Embryoproduktion in vivo sowie in vitro
voraussagen können, durchgeführt. Dafür wurden Geburtenbücher und -protokolle
unserer Affenkolonie herangezogen, sowie Hormonwerte und Ergebnisse der in
vitro Versuche. In Kürze, eine höhere Embryoproduktion wurde bei jüngeren
Tieren mit moderatem Gewicht (370-470 g) und niedrigerem Blut- Progesteron
Spiegel beobachtet, die von Mütter stammten, welche kleinere Wurfgrößen und
kürzere Zeitabstande zwischen zwei Geburten hatten, die als Indikatoren für
normale Ovarfunktion gelten. Weiter wurde der Einfluss von externen Faktoren
auf die reproduktive Funktion aufgezeigt durch retrospektive Analyse von in
vivo Behandlungen von weiblichen Weißbüschelaffen mit einem
Breitbandantibiotikum Enrofloxacin. Dieses Antibiotikum wird routinemäßig zur
Behandlung gegen E.coli, den Hauptverursacher von rezidivierenden blutigen
Durchfällen in unsere Kolonie, verwendet. Bis jetzt wurde nach unserer
Kenntnis noch nie über mögliche Effekte des Antibiotikums auf das weibliche
Reproduktionssystem, in Besonderem auf die Follikulo- und Gametogenese
publiziert. Die vorliegende Studie zeigt, dass Enrofloxacin die
Follikelentwicklung unterdrückt, wobei es auf Primär-/Sekundärfollikel
einwirkt, vermutlich durch die Unterdrückung der Kumuluszellteilung. Der
Enrofloxacin¬-Einfluss wurde am deutlichsten ca. 7 Wochen nach der Behandlung
und zeigte sich durch niedrige Anzahlen an gewonnen KOK und drastisch
reduzierten Befruchtungs- und Furchungsraten. Zusammengefasst zeigt die
vorliegende Dissertationsarbeit ein optimiertes, funktionierendes System zur
in vitro Embryoproduktion aus in vivo sowie in vitro gereiften Oozyten von
Weißbüschelaffen. Dies hebt die Unterschiede in initialer Oozytenqualität und
deren Einfluss auf Erfolg des Versuches hervor, hinweisend auf die
Notwendigkeit durch sorgfältige Haltung die Gesundheit der Versuchstiere zu
erhalten und zu ermutigen die Weißbüschelaffen effektiver in der reproduktiven
Forschung einzusetzen.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
gonadotrophins
dc.subject
colony management
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
In vitro oocyte maturation and embryo production in the common marmoset
(Callithrix jacchus)
dc.contributor.contact
tkachenkoe@list.ru, olenatkachenko@googlemail.com
dc.contributor.firstReferee
Prof. H. Hofer
dc.contributor.furtherReferee
Prof. U. Eichenlaub-Ritter
dc.date.accepted
2012-04-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000037526-8
dc.title.translated
In-vitro-Oozytenreifung und Embryonenerzeugung von Oozyten des
Weißbüschelaffen
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000037526
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011093
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open access
