Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ermittlung der Kristallstruktur des Plasmid kodierten δ-Proteins im Zusammenhang eines möglichen Par-Systems in pSM19035. Das Plasmid pSM19035 wurde ursprünglich aus dem grampositiven und humanpathogenen Bakterium Streptococcus pyogenes isoliert und kommt dort in niedriger Kopienzahl vor. Zu Beginn der hier durchgeführten Versuche war bereits bekannt, dass dieses zur Inc18-Familie gehörende Plasmid mit breitem Wirtsspektrum für ein effektives Toxin-Antitoxin-System kodiert (--TA- System), welches unter der Kontrolle des ω-Repressor-Proteins steht. Die Existenz eines kompletten Par-Systems in pSM19035 mit allen dazu gehörenden Komponenten wie ein ParA-Protein als ATPase, ein DNA-bindendes ParB-Protein und eine Zentromer-ähnliche DNA-Region (parS-DNA) war nicht bekannt. Die Primärsequenzanalyse zu ORF delta (δ), das sich unmittelbar flussaufwärts vom ω-Gen befindet, klassifizierte δ als eine ParA-homologe Walker-Type-ATPase. Es wird vermutet, dass diese ParA-homologen ATPasen in die DNA-Segregation bzw. Plasmidverteilung bei Prokaryonten verwickelt sind. Das Gen δ wurde in E. coli kloniert und in ER2566 überexprimiert. Zur Reinigung des Proteins (34.5 kDa) wurde ein Reinigungsprotokoll erstellt und optimiert. Nachdem der Reinheitsgrad des Proteins durch mehrere Methoden nachgewiesen wurde, wurde das homogene Protein im Komplex mit ATPγS co-kristallisiert. Die Röntgenbeugungsdaten wurden mit der Synchrotonstrahlung am Strahlrohr BL 1 vom BESSY (Berlin) gesammelt (max. Auflösung: 1.83 Å) und die dreidimensionale Struktur des Proteins mittels molekularen Ersatzes unter Verwendung der Atomkoordinaten des Soj-Proteins von T. thermophilus als Suchmodell bestimmt. Das hier vorgestellte Strukturmodell ist die erste Struktur eines Plasmid kodierten ParA-Typ-Proteins in seiner ATPγS und Mg2+ bindenden Form (δ•ATPγS/Mg2+)2. Die Struktur des δ2-Proteins ist ein Homodimer mit einer „V förmigen“ Kluft zwischen beiden Monomeren. Die in dieser Kluft befindlichen ATP-Bindetaschen werden jeweils von einem ATPγS-Molekül und einem Mg2+-Ion belegt. Das elektrostatische Oberflächenpotential vom Komplex (δ•ATPγS)2 zeigt, dass das Dimer δ2 eine überwiegend negativ geladene untere und eine positiv geladene obere Seite aufweist. Diese Polarität des Proteins deutet darauf hin, dass es mit seiner positiv geladenen oberen Seite mit der DNA oder mit der negativ geladenen Seite des ParB-Proteins interagieren könnte Im Gegensatz zum chromosomal kodierten Soj von B. subtilis, welches nur in Gegenwart von ATP in die Dimer-Form übergeht, liegt δ2 in Lösung ohne Nukleotid-Zusatz als Dimer vor. Die Ergebnisse des ATPase-Assays zeigen, dass δ2 in der Lage ist, ATP zu hydrolysieren. Wenn der Reaktion jedoch zusätzlich die parS-DNA und das zweite Protein, nämlich das ParB-Analoge ω2 zugefügt werden, steigt die Enzymaktivität des δ2-Proteins um das Sechsfache, während die N-terminale Deletionsmutante ω2∆N19 nicht stimuliert. Dies zeigt, dass die deletierten 19 Reste bei der Hydrolyse des ATP eine entscheidende Rolle spielen. Die auf drei Komponenten basierende Interaktion (δ2-ω2-DNA) wurde auch durch DLS- und Sedimentations-Versuche sowie durch elektronenmikroskopische Beobachtungen bestätigt. Die letzteren drei Versuche deuten darauf hin, dass δ2 auch in der Lage ist, in Gegenwart von ω2 und parS- DNA zu polymerisieren bzw. Nukleoproteinfilamente zu bilden. Die Existenz dieser eventuell bipolaren Filamente könnte die Verschiebung des Nukleoids von der Mitte der Zelle zu den Zellpolen in B. subtilis erklären. Da die ATPase- Aktivität von δ2 in Gegenwart von ω2 und parS-DNA stimuliert wird und da diese erhöhte ATPase-Aktivität die Depolymerisation von δ2 beginnt, ist anzunehmen, dass der Filamentabbau an der ω2•parS-DNA startet. Das hier vorgestellte Strukturmodell und die erzielten Ergebnisse in der Funktionsanalyse haben einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung des gesamten Segregationsmechanismus vom Plasmid pSM19035 geleistet.
The main aim of this work was the determination of the three dimensional structure of the δ-protein encoded by low-copy-number plasmid pSM19035 of Gram-positive bacteria Streptococcus pyogenes. The crystal structures of the proteins (ε and ζ) involved in the toxin- antitoxin system (TA system) and their transcription regulator, the ω-repressor protein, were already known. However, the concomitance of a second plasmid segregation system like a partitioning system and the presence of its main components (ParA, ParB and parS DNA) on this plasmid were not well clarified. The primary sequence alignment of the ORF delta (δ) located upstream of ω gene classified δ as a ParA-homologous Walker-type ATPase and it was suggested to be involved in the faithful DNA segregation in prokaryotic microorganisms. The gene δ (ORF delta) encoding the potential partitioning protein δ was cloned in E. coli cloning strain DH5α and transformed into ER2566 for overproduction. A protocol for the purification of the protein (298 residues) was developed and optimised. The purity level of the protein has been verified and it was finally co- crystallised in complex with ATPγS. The X-ray diffraction data were collected with a max. resolution of 1.83 Ǻ at beam line BL1 of BESSY. The three dimensional structure of the protein was determined via molecular replacement (MR) using a homology model of δ based on Soj protein structure of T. thermophilus (PDB-Id 2BEJ) as search model. Following the solution of the phase problem with MR, a structural model was built and refined. The asymmetric unit contains one δ•ATPγS complex, however, packing analysis revealed a crystallographic two fold axis relating two δ•ATPγS that contact each via a large hydrophobic interface. The crystal structure shows δ2 as a “V-shaped” homodimer featuring a deep cleft between the two monomers. One ATP binding site on each arm of the “V” is occupied by an ATPγS molecule and a Mg2+ atom. Furthermore, electrostatic surface potential calculations indicate that δ2 is bipolar with a negatively charged bottom of the “V” and positively charged tips. The bipolarity of the δ2 dimer indicates that it might be involved in DNA binding or may interact with the negatively charged bottom of a subsequent dimer when forming polymers with two poles. The described structural model is the first reported structure of a plasmid encoded ParA- type protein in the ATPγS- and Mg2+-binding state (δ•ATPγS/Mg2+)2. Despite moderate sequence identities, a structure similarity search for δ monomer using the Dali server identified best matches for the ParA family proteins Soj of T. thermophilus and MinD of A. fulgidus and also for another Walker-type ATPase like NifH. By contrast, the structure of the homodimer (δ•ATPγS)2 exhibits significant differences compared to the dimers formed by Soj and MinD. They are monomeric in absence of ATP, but form compact dimers upon ATP binding. The results of ATPase-Assay indicate that δ2 is able to hydrolyse ATP. The enzyme activity of the protein seems to be stimulated in the presence of wt-ω2 protein (ParB) and the centromer like DNA-sites (parS1, parS2 and parS3). However, this stimulation could not be observed in the presence of the N-terminal deletion mutant ω2∆N19, indicating that the residues involved in the stimulation of ATPase activity of δ2 have to be located among these deleted 19 residues. The dependence of these three components, omega, delta and DNA, to form nucleoprotein filaments, has been confirmed by dynamic light scattering- and sedimentationassays as well as by electronmicroscopy. The results of recent experiments indicate that δ2 seems to be able to form dynamically nucleoprotein filaments in the presence of wt-ω2, parS DNA and ATP. These possibly bipolar nucleoprotein filaments might elucidate the movement of the nucleoid from the midcell position to the cell poles observed by the in vivo localisation of δ2 -GFP-fusion in B. subtilis. The presented structure model and the additionally performed functional analysis are making a contribution to the clarification of the whole segregation mechanism of plasmid pSM19035 of the human pathogenic bacterium S. pyogenes.
