dc.contributor.author
Cicek, Aslan
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:33:40Z
dc.date.available
2009-07-24T07:02:57.674Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10650
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14848
dc.description.abstract
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Ermittlung der Kristallstruktur des
Plasmid kodierten δ-Proteins im Zusammenhang eines möglichen Par-Systems in
pSM19035. Das Plasmid pSM19035 wurde ursprünglich aus dem grampositiven und
humanpathogenen Bakterium Streptococcus pyogenes isoliert und kommt dort in
niedriger Kopienzahl vor. Zu Beginn der hier durchgeführten Versuche war
bereits bekannt, dass dieses zur Inc18-Familie gehörende Plasmid mit breitem
Wirtsspektrum für ein effektives Toxin-Antitoxin-System kodiert (--TA-
System), welches unter der Kontrolle des ω-Repressor-Proteins steht. Die
Existenz eines kompletten Par-Systems in pSM19035 mit allen dazu gehörenden
Komponenten wie ein ParA-Protein als ATPase, ein DNA-bindendes ParB-Protein
und eine Zentromer-ähnliche DNA-Region (parS-DNA) war nicht bekannt. Die
Primärsequenzanalyse zu ORF delta (δ), das sich unmittelbar flussaufwärts vom
ω-Gen befindet, klassifizierte δ als eine ParA-homologe Walker-Type-ATPase. Es
wird vermutet, dass diese ParA-homologen ATPasen in die DNA-Segregation bzw.
Plasmidverteilung bei Prokaryonten verwickelt sind. Das Gen δ wurde in E. coli
kloniert und in ER2566 überexprimiert. Zur Reinigung des Proteins (34.5 kDa)
wurde ein Reinigungsprotokoll erstellt und optimiert. Nachdem der
Reinheitsgrad des Proteins durch mehrere Methoden nachgewiesen wurde, wurde
das homogene Protein im Komplex mit ATPγS co-kristallisiert. Die
Röntgenbeugungsdaten wurden mit der Synchrotonstrahlung am Strahlrohr BL 1 vom
BESSY (Berlin) gesammelt (max. Auflösung: 1.83 Å) und die dreidimensionale
Struktur des Proteins mittels molekularen Ersatzes unter Verwendung der
Atomkoordinaten des Soj-Proteins von T. thermophilus als Suchmodell bestimmt.
Das hier vorgestellte Strukturmodell ist die erste Struktur eines Plasmid
kodierten ParA-Typ-Proteins in seiner ATPγS und Mg2+ bindenden Form
(δ•ATPγS/Mg2+)2. Die Struktur des δ2-Proteins ist ein Homodimer mit einer „V
förmigen“ Kluft zwischen beiden Monomeren. Die in dieser Kluft befindlichen
ATP-Bindetaschen werden jeweils von einem ATPγS-Molekül und einem Mg2+-Ion
belegt. Das elektrostatische Oberflächenpotential vom Komplex (δ•ATPγS)2
zeigt, dass das Dimer δ2 eine überwiegend negativ geladene untere und eine
positiv geladene obere Seite aufweist. Diese Polarität des Proteins deutet
darauf hin, dass es mit seiner positiv geladenen oberen Seite mit der DNA oder
mit der negativ geladenen Seite des ParB-Proteins interagieren könnte Im
Gegensatz zum chromosomal kodierten Soj von B. subtilis, welches nur in
Gegenwart von ATP in die Dimer-Form übergeht, liegt δ2 in Lösung ohne
Nukleotid-Zusatz als Dimer vor. Die Ergebnisse des ATPase-Assays zeigen, dass
δ2 in der Lage ist, ATP zu hydrolysieren. Wenn der Reaktion jedoch zusätzlich
die parS-DNA und das zweite Protein, nämlich das ParB-Analoge ω2 zugefügt
werden, steigt die Enzymaktivität des δ2-Proteins um das Sechsfache, während
die N-terminale Deletionsmutante ω2∆N19 nicht stimuliert. Dies zeigt, dass die
deletierten 19 Reste bei der Hydrolyse des ATP eine entscheidende Rolle
spielen. Die auf drei Komponenten basierende Interaktion (δ2-ω2-DNA) wurde
auch durch DLS- und Sedimentations-Versuche sowie durch
elektronenmikroskopische Beobachtungen bestätigt. Die letzteren drei Versuche
deuten darauf hin, dass δ2 auch in der Lage ist, in Gegenwart von ω2 und parS-
DNA zu polymerisieren bzw. Nukleoproteinfilamente zu bilden. Die Existenz
dieser eventuell bipolaren Filamente könnte die Verschiebung des Nukleoids von
der Mitte der Zelle zu den Zellpolen in B. subtilis erklären. Da die ATPase-
Aktivität von δ2 in Gegenwart von ω2 und parS-DNA stimuliert wird und da diese
erhöhte ATPase-Aktivität die Depolymerisation von δ2 beginnt, ist anzunehmen,
dass der Filamentabbau an der ω2•parS-DNA startet. Das hier vorgestellte
Strukturmodell und die erzielten Ergebnisse in der Funktionsanalyse haben
einen wichtigen Beitrag zur Aufklärung des gesamten Segregationsmechanismus
vom Plasmid pSM19035 geleistet.
de
dc.description.abstract
The main aim of this work was the determination of the three dimensional
structure of the δ-protein encoded by low-copy-number plasmid pSM19035 of
Gram-positive bacteria Streptococcus pyogenes. The crystal structures of the
proteins (ε and ζ) involved in the toxin- antitoxin system (TA system) and
their transcription regulator, the ω-repressor protein, were already known.
However, the concomitance of a second plasmid segregation system like a
partitioning system and the presence of its main components (ParA, ParB and
parS DNA) on this plasmid were not well clarified. The primary sequence
alignment of the ORF delta (δ) located upstream of ω gene classified δ as a
ParA-homologous Walker-type ATPase and it was suggested to be involved in the
faithful DNA segregation in prokaryotic microorganisms. The gene δ (ORF delta)
encoding the potential partitioning protein δ was cloned in E. coli cloning
strain DH5α and transformed into ER2566 for overproduction. A protocol for the
purification of the protein (298 residues) was developed and optimised. The
purity level of the protein has been verified and it was finally co-
crystallised in complex with ATPγS. The X-ray diffraction data were collected
with a max. resolution of 1.83 Ǻ at beam line BL1 of BESSY. The three
dimensional structure of the protein was determined via molecular replacement
(MR) using a homology model of δ based on Soj protein structure of T.
thermophilus (PDB-Id 2BEJ) as search model. Following the solution of the
phase problem with MR, a structural model was built and refined. The
asymmetric unit contains one δ•ATPγS complex, however, packing analysis
revealed a crystallographic two fold axis relating two δ•ATPγS that contact
each via a large hydrophobic interface. The crystal structure shows δ2 as a
“V-shaped” homodimer featuring a deep cleft between the two monomers. One ATP
binding site on each arm of the “V” is occupied by an ATPγS molecule and a
Mg2+ atom. Furthermore, electrostatic surface potential calculations indicate
that δ2 is bipolar with a negatively charged bottom of the “V” and positively
charged tips. The bipolarity of the δ2 dimer indicates that it might be
involved in DNA binding or may interact with the negatively charged bottom of
a subsequent dimer when forming polymers with two poles. The described
structural model is the first reported structure of a plasmid encoded ParA-
type protein in the ATPγS- and Mg2+-binding state (δ•ATPγS/Mg2+)2. Despite
moderate sequence identities, a structure similarity search for δ monomer
using the Dali server identified best matches for the ParA family proteins Soj
of T. thermophilus and MinD of A. fulgidus and also for another Walker-type
ATPase like NifH. By contrast, the structure of the homodimer (δ•ATPγS)2
exhibits significant differences compared to the dimers formed by Soj and
MinD. They are monomeric in absence of ATP, but form compact dimers upon ATP
binding. The results of ATPase-Assay indicate that δ2 is able to hydrolyse
ATP. The enzyme activity of the protein seems to be stimulated in the presence
of wt-ω2 protein (ParB) and the centromer like DNA-sites (parS1, parS2 and
parS3). However, this stimulation could not be observed in the presence of the
N-terminal deletion mutant ω2∆N19, indicating that the residues involved in
the stimulation of ATPase activity of δ2 have to be located among these
deleted 19 residues. The dependence of these three components, omega, delta
and DNA, to form nucleoprotein filaments, has been confirmed by dynamic light
scattering- and sedimentationassays as well as by electronmicroscopy. The
results of recent experiments indicate that δ2 seems to be able to form
dynamically nucleoprotein filaments in the presence of wt-ω2, parS DNA and
ATP. These possibly bipolar nucleoprotein filaments might elucidate the
movement of the nucleoid from the midcell position to the cell poles observed
by the in vivo localisation of δ2 -GFP-fusion in B. subtilis. The presented
structure model and the additionally performed functional analysis are making
a contribution to the clarification of the whole segregation mechanism of
plasmid pSM19035 of the human pathogenic bacterium S. pyogenes.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Plasmid Segregation
dc.subject
Partitioning of Plasmid
dc.subject
Crystal Structure
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Struktur und Funktion des ParA-homologen δ-Proteins, kodiert vom Plasmid
pSM19035 aus Streptococcus pyogenes
dc.contributor.contact
cicekas@chemie.fu-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof.Dr. Wolfram Saenger
dc.contributor.furtherReferee
Prof.Dr. Heinz Welfle/ Prof. Dr. Volker Haucke
dc.date.accepted
2009-07-15
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000011681-2
dc.title.translated
X-Ray crystal structure and function of ParA homologue δ-Protein, encoded by
plasmid pSM19035 from Streptococcus pyogenes
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000011681
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006032
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access