The present work focuses on the quaternary structure of rhodopsin and its possible implications for the function of the receptor as a light transducer. Rhodopsin is a prototypical G protein- coupled receptor (GPCR) that is found in high concentrations in the discs of the outer segment of rod photoreceptor cells. Its physiological function is the transduction of light into a biological relevant signal under dim light conditions. There is growing evidence that GPCRs form and might even function as oligomers in membranes (Milligan, Ramsay et al. 2003; Milligan 2006). Oligomers were also reported for rhodopsin by atomic force microscopy (Fotiadis, Liang et al. 2003), chemical cross-linking (Jastrzebska, Maeda et al. 2004; Medina, Perdomo et al. 2004; Jastrzebska, Fotiadis et al. 2006), blue native electrophoresis (Jastrzebska, Maeda et al. 2004) and FRET studies (Kota, Reeves et al. 2006; Mansoor, Palczewski et al. 2006). This view is challenged by early biophysical and biochemical studies suggesting that rhodopsin is monomeric (Cone 1972; Poo and Cone 1974; Chabre 1975; Chabre and le Maire 2005). However, it remains to be elucidated whether its quaternary structure is of any physiological significance for visual signal transduction. In the present thesis, I investigated rhodopsin’s propensity to oligomerize in the plasma membrane of HEK293 and COS-1 cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) as techniques. As possible interaction domains for rhodopsin oligomers, helices IV and V (Liang, Fotiadis et al. 2003) as well as helices I, II and VIII (Salom, Lodowski et al. 2006) have been proposed so far. In my thesis, I also tried to verify possible interaction domains using FRET competition experiments. Furthermore, I was interested in investigating whether a change in rhodopsin’s quaternary structure alters its ability of binding or activating its G protein transducin (Gt). For this question I used purified, solubilized rhodopsin and rhodopsin fusion proteins in 0.01% DM to measure FRET as well as Gt activation rates. I found that BiFC yields fluorescing cells upon coexpression of several unrelated membrane and non-membrane proteins with opsin. This suggests that it is not a suitable test for specific membrane protein interaction. Furthermore, I found that opsin shows very high FRET efficiency in the plasma membranes of HEK293 and COS-1 cells. The FRET competition data confirms the idea of helix IV/V as part of the oligomerization interface. When detergent is added to purified membranes as well as to HEK293 cells in vivo, FRET efficiency decreases significantly. In purified, solubilized samples (0.01% DM), no FRET could be measured at all. Under the chosen experimental conditions, solubilized rhodopsin therefore appears to be present as a monomer. Nevertheless, measurements of Gt activation revealed that monomeric rhodopsin efficiently activates its cognate G protein at high rates (Vmax of 40 Gt/s, KM of 3.3 µM). Monomeric rhodopsin therefore works with a specificity constant of 1.3∙10-7M-1s-1, which is close to the diffusion limit (Berg and von Hippel 1985) and can thus be called a ‘perfect enzyme’.
In der hier vorliegenden Doktorarbeit wurde die Quartärstruktur von Rhodopsin und ihre Rolle für die Weiterleitung von Lichtsignalen an das G-Protein Transducin untersucht. Rhodopsin ist ein prototypischer G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR), der in hohen Konzentrationen in den Membranen der Disks der Stäbchenaußensegmente vorkommt. Seine physiologische Funktion ist die Übersetzung von Licht in ein biologisch verwertbares Signal unter Dämmerlicht Bedingungen. Es gibt zunehmend Hinweise, dass GPCRs oligomere Strukturen bilden, die möglicherweise auch ihre funktionellen Einheit darstellen (Milligan, Ramsay et al. 2003; Milligan 2006). Mit Hilfe von Techniken wie atomic force microscopy ( Fotiadis, Liang et al. 2003), cross-linking (Jastrzebska, Maeda et al. 2004; Medina, Perdomo et al. 2004; Jastrzebska, Fotiadis et al. 2006), blue native gel electrophoresis (Jastrzebska, Maeda et al. 2004) und fluorescence resonance energy transfer (FRET) (Kota, Reeves et al. 2006; Mansoor, Palczewski et al. 2006) wurden auch für Rhodopsin Oligomere als Quartärstruktur postuliert. Diese Experimente stehen aber im Widerspruch zu Resultaten aus früheren biophysikalischen und biochemischen Experimenten, in denen keinerlei Evidenz für eine dimere/oligomere Quartärstruktur zu finden war (Cone 1972, Poo und Cone 1974; Chabre 1975; Chabre und le Maire 2005). Weiterhin bleibt zudem unklar, ob eine Oligomerisierung relevant für die physiologische Funktion von Rhodopsin als Licht Rezeptor in vivo ist. In der hier präsentierten Arbeit wurde die Dimerisierung von Rhodopsin in der Plasmamembran von HEK293 und COS-1 Zellen mit Hilfe von bimolecular fluorescence complementation assay (BiFC) und FRET untersucht. Als mögliche Interaktionsdomainen der Oligomerbildung von Rhodopsin wurden bisher Helices IV und V (Liang, Fotiadis et al. 2003) als auch Helices I, II, und VII (Salom, Lodowski et al. 2006) postuliert. In der vorliegenden Arbeit wurden mögliche Interaktionsdomainen der Rhodopsin Oligomerbildung mit Hilfe von FRET untersucht. Weiterhin sollte untersucht werden, ob eine Änderung der Quartärstruktur auch zu einer Änderung in der Katalyseeffizienz der G-Protein Aktivierung führt. Für diese Frage wurde solubilisiertes Rhodopsin und entsprechende Rhodopsin-Fluorophor Fusionsproteine in 0,01% DM präpariert, um G-Protein Aktivierungsraten als auch FRET zu messen. Es zeigt sich, dass die Koexpression von komplementären Opsin-BiFC Fusionsproteinen zu einem starken Fluoreszenzsignal in vivo führte. Die Tatsache, das auch die Koexpression von verschiedener anderer -membranständiger als auch zytoplasmatischer- Proteine als BiFC Konstrukte mit einem komplementären Opsin-BiFC Konstrukt Fluoreszenz zeigten, legt allerdings nahe, dass BiFC kein spezifischer Marker für intermolekulare Interaktion von Membranproteinen ist. FRET Experimente mit geeigneten Opsin-Fluorophor Fusionsproteinen ergaben eine hohe FRET Effizienz in der Plasmamembran von transfizierten HEK293 and COS-1 Zellen. Die FRET Kompetitionsexperimente unterstrichen weiterhin die Theorie, dass Helices IV and V eine Rolle bei der Oligomerisierung spielen. Wenn das Detergens Dodecylmaltosid (DM) zu gereinigten COS-1 Membranen oder HEK293 Zellen in vivo gegeben wurde, verringerte sich die FRET Effizienz signifikant. In aufgereinigten, solubilisierten Proben (0,01% DM) konnte überhaupt kein FRET Signal mehr gemessen werden. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass Rhodopsin in 0,01% DM als Monomer vorliegt. Unter denselben experimentellen Bedingungen wurde auch die katalytische G-Protein Aktivierungskapazität von gereinigtem Rhodopsin bestimmt. Es zeigte sich, dass monomeres Rhodopsin sehr effizient in der Lage ist Transducin zu aktivieren (Vmax = 40 Gt/s, KM = 3,3 µM). Daraus folgt, dass monomeres Rhodopsin mit einer Spezifizitätskonstante von 1,3•10-7 M-1s-1 nahe am theoretisch möglichen Diffusionslimit arbeitet, (Berg und von Hippel 1985) und somit als so genanntes ‚perfektes Enzym’ beschrieben werden kann.
