Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein in vitro Model epidermaler Keratinozyten der Rinderklaue, sowie ein organotypisches Modell dieses Gewebes etabliert und charakterisiert. Aufgrund der anatomischen Verhältnisse an der Rinderklaue war eine Modifikation der für Epidermiszellen der Haut beschriebenen Isolierungstechniken notwendig. Die isolierten Zellen konnten unter Standardbedingungen (37°C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre) angezüchtet und subkultiviert werden. Da in der Rinderklaue Dermis und Epidermis über eine innige und stark verzahnte Verbindung verfügen, wurde in den Primärkulturen immer ein variierender Anteil dermaler Fibrozyten mit angezüchtet. Mit Hilfe verschiedener Methoden gelang es Reinkulturen der Keratinozyten zu gewinnen. Die Untersuchungen ergaben, dass die Reinkulturen nur langsam wuchsen und nur unvollständig differenzierte Keratinozytenkolonien ausbildeten. In Kokulturen mit einem Fibrozytenanteil von bis zu einem Drittel wurden jedoch dreidimensionale, organotypische Keratinozytenkolonien mit gewebespezifischer Differenzierung ausgebildet.
Mit Hilfe immunhistochemischer Methoden konnte die Expression von gewebespezifischen Keratinproteinen nachgewiesen werden. Mit der Elektrophorese (SDS-PAGE) und dem Western Blot erfolgte eine genaue Zuordnung der Keratinproteine. Folgende Keratine wurden von den Kulturen exprimiert: K1-3, K4/5, K6, K13/14 und K16. Licht- und elektronmikroskopische Untersuchungen zeigten, dass in den organotypischen Kulturen die charakteristischen Merkmale der Klauenepidermis in vivo vorzufinden waren. In diesen Kulturen waren drei unterschiedliche differenzierte Zellschichten erkennbar. Eine basale Zellschicht direkt auf dem Kultivierungsgefäß, gefolgt von bis zu 18 Lagen Stachelzellen, die dem Stratum spinosum der Klauenepidermis in vivo entsprachen. Des Weiteren eine superfizielle Zellschicht mit mehreren Lagen unterschiedlich stark verhornter Zellen. Bei den ultrastrukturellen Untersuchungen waren Intermediärfilamente sichtbar, die ein Zytoskelett ausbildeten. Dieses Zytoskelett war in typischer Weise mit den Desmosomen assoziiert. Mit dem immunogold labelling wurde nachgewiesen, dass es sich bei diesen Intermediärfilamenten um Keratinfilamente handelte. In der intermediären Zellschicht waren membrane coating granules, spezifische Zellorganellen epidermaler Epithelzellen, sichtbar. Interzellularkitt konnte in blasig erweiterten Interzellularspalten beobachtet werden. In den oberen Zelllagen waren folgende Merkmale der terminalen Differenzierung nachweisbar: cornified envelopes und solide verhornte Zellen.
Neben der Etablierung einer normalen Zellkultur, die mehrere Zelllinien umfasste, konnte erstmals ein organotypisches Modell der Rinderklaue beschrieben werden. Das organotypische Modell ist besonders für weitere Untersuchungen dermoepidermaler Interaktionen geeignet, denen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von Klauenerkrankungen zukommt. Aber auch die gewöhnliche Zellkultur ist z.B. für das Studium einzelner das Wachstum beeinflussender Faktoren von großer Bedeutung. Zusätzlich können Adhäsion und zytopathische Effekte von Bakterien, die eine Rolle bei infektiösen Klauenerkrankungen spielen, untersucht werden.
This thesis describes an in vitro model of epidermal keratinocytes originating from the bovine hoof and an organotypic in vitro model of hoof tissue for the first time. Both models have been established and characterised. Because of the specific morphology of the claw a number of modifications of isolation techniques described for epidermal cells of the skin were required. The isolated cells were cultured and subcultivated under standard conditions, i.e. 37 °C, 5% CO2, 90 % humidity. Because of the intimate spatial interdigitation of dermis and epidermis of the claw the primary isolates of keratinocytes were always contaminated by dermal fibroblasts to a certain degree. It was possible to establish cell lines of keratinocytes by using different separation methods. Pure keratinocyte cultures grew very slowly and only incomplete differentiated colonies were formed. Co-cultures of keratinocytes with up to 30 percent fibroblasts formed three dimensional, organotypic colonies showing a tissue specific differentiation. A region specific differentiation, however, was not detectable in these oganotypic cultures. The high degree of differentiation is related to the fibroblast growth factors synthesised by dermal fibroblasts.
Using immunohistochemical methods the expression of tissue specific keratin proteins was detected. These findings were verified and individual keratins identified by separation of tissue protein extracts by SDS-PAGE electrophoreses and subsequent Western blotting. Cultured keratinocytes expressed the following keratin proteins: K 1-3, K4/5, K6; K 13/14 and K 16. Light- and electron microscopic examination of the organotypic cultures revealed morphological features characteristic of hoof epidermis. As in hoof tissue, three layers with different stages of differentiation were present. Their spatial arrangement resembled the in vivo situation. A basal layer was located directly on the surface of the culture plate followed by up to 18 layers of spiny cells. The superficial stratum consisted of several layers of completely as well as incompletely cornified cells. The electron microscopic examination demonstrated intermediate filaments establishing a three dimensional cytoskeleton associated with the desmosomes in a typical manner. Immunogold labelling identified the filaments as keratin proteins. Membrane coating granules, the specific organelles of epidermal cells, were present in the intermediate layers. Their contents, the intercellular cementing substance (membrane coating material - MCM), was demonstrated in the intercellular spaces after extrusion by exocytosis. Formation of a cornified envelope and cornification were demonstrated in the superficial layers indicating terminal differentiation.
The organotypic culture described here for the first time is a helpful tool for studying dermo-epidermal interacions, which have been reported frequently to play a key role in the pathogenesis of claw diseases and laminitis in particular. The cell lines will be of great importance for studies on the influence of single bioactive molecules and growth factors on proliferation and cellular responses. Furthermore, adhesion and cytopathic effects of bacteria involved in the aetiology of infectious claw diseases can be studied.
