dc.contributor.author
Nebel, Ulrike
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:06:49Z
dc.date.available
2005-02-23T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/10071
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14269
dc.description
Titelblatt, Inhaltsverzeichnis, Danksagung etc.
1. Abkürzungen
2. Einleitung
3. Literaturübersicht
4. Material und Methoden
5. Untersuchungsergebnisse
6. Diskussion
7. Zusammenfassung
8. Summary
9. Abbildungen
10\. Literaturverzeichnis
11\. A nhang
dc.description.abstract
Mit der vorliegenden Arbeit wurde ein in vitro Model epidermaler Keratinozyten
der Rinderklaue, sowie ein organotypisches Modell dieses Gewebes etabliert und
charakterisiert. Aufgrund der anatomischen Verhältnisse an der Rinderklaue war
eine Modifikation der für Epidermiszellen der Haut beschriebenen
Isolierungstechniken notwendig. Die isolierten Zellen konnten unter
Standardbedingungen (37°C, 5% CO2, feuchte Atmosphäre) angezüchtet und
subkultiviert werden. Da in der Rinderklaue Dermis und Epidermis über eine
innige und stark verzahnte Verbindung verfügen, wurde in den Primärkulturen
immer ein variierender Anteil dermaler Fibrozyten mit angezüchtet. Mit Hilfe
verschiedener Methoden gelang es Reinkulturen der Keratinozyten zu gewinnen.
Die Untersuchungen ergaben, dass die Reinkulturen nur langsam wuchsen und nur
unvollständig differenzierte Keratinozytenkolonien ausbildeten. In Kokulturen
mit einem Fibrozytenanteil von bis zu einem Drittel wurden jedoch
dreidimensionale, organotypische Keratinozytenkolonien mit gewebespezifischer
Differenzierung ausgebildet.
Mit Hilfe immunhistochemischer Methoden konnte die Expression von
gewebespezifischen Keratinproteinen nachgewiesen werden. Mit der
Elektrophorese (SDS-PAGE) und dem Western Blot erfolgte eine genaue Zuordnung
der Keratinproteine. Folgende Keratine wurden von den Kulturen exprimiert:
K1-3, K4/5, K6, K13/14 und K16. Licht- und elektronmikroskopische
Untersuchungen zeigten, dass in den organotypischen Kulturen die
charakteristischen Merkmale der Klauenepidermis in vivo vorzufinden waren. In
diesen Kulturen waren drei unterschiedliche differenzierte Zellschichten
erkennbar. Eine basale Zellschicht direkt auf dem Kultivierungsgefäß, gefolgt
von bis zu 18 Lagen Stachelzellen, die dem Stratum spinosum der
Klauenepidermis in vivo entsprachen. Des Weiteren eine superfizielle
Zellschicht mit mehreren Lagen unterschiedlich stark verhornter Zellen. Bei
den ultrastrukturellen Untersuchungen waren Intermediärfilamente sichtbar, die
ein Zytoskelett ausbildeten. Dieses Zytoskelett war in typischer Weise mit den
Desmosomen assoziiert. Mit dem immunogold labelling wurde nachgewiesen, dass
es sich bei diesen Intermediärfilamenten um Keratinfilamente handelte. In der
intermediären Zellschicht waren membrane coating granules, spezifische
Zellorganellen epidermaler Epithelzellen, sichtbar. Interzellularkitt konnte
in blasig erweiterten Interzellularspalten beobachtet werden. In den oberen
Zelllagen waren folgende Merkmale der terminalen Differenzierung nachweisbar:
cornified envelopes und solide verhornte Zellen.
Neben der Etablierung einer normalen Zellkultur, die mehrere Zelllinien
umfasste, konnte erstmals ein organotypisches Modell der Rinderklaue
beschrieben werden. Das organotypische Modell ist besonders für weitere
Untersuchungen dermoepidermaler Interaktionen geeignet, denen eine
entscheidende Rolle in der Pathogenese von Klauenerkrankungen zukommt. Aber
auch die gewöhnliche Zellkultur ist z.B. für das Studium einzelner das
Wachstum beeinflussender Faktoren von großer Bedeutung. Zusätzlich können
Adhäsion und zytopathische Effekte von Bakterien, die eine Rolle bei
infektiösen Klauenerkrankungen spielen, untersucht werden.
de
dc.description.abstract
This thesis describes an in vitro model of epidermal keratinocytes originating
from the bovine hoof and an organotypic in vitro model of hoof tissue for the
first time. Both models have been established and characterised. Because of
the specific morphology of the claw a number of modifications of isolation
techniques described for epidermal cells of the skin were required. The
isolated cells were cultured and subcultivated under standard conditions, i.e.
37 °C, 5% CO2, 90 % humidity. Because of the intimate spatial interdigitation
of dermis and epidermis of the claw the primary isolates of keratinocytes were
always contaminated by dermal fibroblasts to a certain degree. It was possible
to establish cell lines of keratinocytes by using different separation
methods. Pure keratinocyte cultures grew very slowly and only incomplete
differentiated colonies were formed. Co-cultures of keratinocytes with up to
30 percent fibroblasts formed three dimensional, organotypic colonies showing
a tissue specific differentiation. A region specific differentiation, however,
was not detectable in these oganotypic cultures. The high degree of
differentiation is related to the fibroblast growth factors synthesised by
dermal fibroblasts.
Using immunohistochemical methods the expression of tissue specific keratin
proteins was detected. These findings were verified and individual keratins
identified by separation of tissue protein extracts by SDS-PAGE
electrophoreses and subsequent Western blotting. Cultured keratinocytes
expressed the following keratin proteins: K 1-3, K4/5, K6; K 13/14 and K 16.
Light- and electron microscopic examination of the organotypic cultures
revealed morphological features characteristic of hoof epidermis. As in hoof
tissue, three layers with different stages of differentiation were present.
Their spatial arrangement resembled the in vivo situation. A basal layer was
located directly on the surface of the culture plate followed by up to 18
layers of spiny cells. The superficial stratum consisted of several layers of
completely as well as incompletely cornified cells. The electron microscopic
examination demonstrated intermediate filaments establishing a three
dimensional cytoskeleton associated with the desmosomes in a typical manner.
Immunogold labelling identified the filaments as keratin proteins. Membrane
coating granules, the specific organelles of epidermal cells, were present in
the intermediate layers. Their contents, the intercellular cementing substance
(membrane coating material - MCM), was demonstrated in the intercellular
spaces after extrusion by exocytosis. Formation of a cornified envelope and
cornification were demonstrated in the superficial layers indicating terminal
differentiation.
The organotypic culture described here for the first time is a helpful tool
for studying dermo-epidermal interacions, which have been reported frequently
to play a key role in the pathogenesis of claw diseases and laminitis in
particular. The cell lines will be of great importance for studies on the
influence of single bioactive molecules and growth factors on proliferation
and cellular responses. Furthermore, adhesion and cytopathic effects of
bacteria involved in the aetiology of infectious claw diseases can be studied.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
keratinization
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
In vitro Modelle proliferierender und differenzierender epidermaler
Keratinozyten der Rinderklaue
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Klaus-Dieter Budras
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolfgang Heuwieser
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. K. Dämmrich
dc.date.accepted
2005-01-28
dc.date.embargoEnd
2005-03-23
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005000549
dc.title.translated
In vitro models of proliferating and differentiating epidermal keratinocytes
from the bovine hoof
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001601
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/54/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001601
dcterms.accessRights.dnb
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dcterms.accessRights.openaire
open access