dc.contributor.author
Blum, Christopher Thorsten Friedrich
dc.date.accessioned
2018-06-07T23:03:35Z
dc.date.available
2005-12-22T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9994
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14192
dc.description
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Einleitung
Material und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zusammenfassung / Summary
Literaturverzeichnis
Danksagungen, Lebenslauf
dc.description.abstract
AKAP-Ht31/AKAP-Lbc gehört zu der Familie der A kinase anchoring proteins. Es
weist eine ubiquitäre Verbreitung auf und ist in seiner Interaktion mit
verschiedenen anderen physiologisch relevanten Proteinen in zahlreiche
regulatorische Zellprozesse eingebunden.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst anti-AKAP-Ht31-Antikörper in Kreuz-
Immunpräzipitationsstudien mit MCF-7-Zellen getestet, um ihre Spezifität gegen
AKAP-Ht31-Spleißvarianten zu charakterisieren. Insgesamt konnten im Western
Blot nach Immunpräzipitation bis zu neun mögliche AKAP-Ht31-Spleißvarianten
mit Molekulargewichten von 70 kDa bis >250 kDa detektiert werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden AKAP-Proteine der Größen 40 kDa, 60
kDa, 80 kDa und 160 kDa in MCF-7-Zellen mittels einer cAMP-Agarose-
Präzipitation angereichert und anhand des RII-overlays detektiert. Der
nukleare Steroid/Thyroid-Rezeptor ERα wurde ebenfalls nach cAMP-Agarose-
Präzipitation im Western Blot detektiert. Dies spricht für das Vorhandensein
eines Komplexes aus einem funktionellen AKAP-Protein, daran gebundenen ERα
und, über die RII-Bindungsdomäne des AKAP-Protein verankerter, PKA.
Die Identifizierung potentiell beteiligter AKAP-Ht31-Spleißvarianten nach
Immunpräzipitation im RII-overlay führte zu vier Proteinen. Zwei Proteine mit
einem Molekulargewicht >220 kDa, von denen das größere wahrscheinlich das
gesamte AKAP-Ht31/AKAP-Lbc (309 kDa) und das kleinere eine weitere AKAP-
Ht31-Spleißvariante oder ein proteolytisches Abbauprodukt darstellt. Des
Weiteren kommt die AKAP-Ht31-Spleißvariante Brx und eine 80-kDa-Protein als
Interaktionspartner von ERα in Frage. In Immunfluoreszenzstudien in
MCF-7-Zellen konnte gezeigt werden, dass zumindest eine AKAP-Ht31-Variante in
unbehandelten Zellen mit ERα kolokalisiert und nach E2-Behandlung mit dem
Rezeptor in den Nukleus transloziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass
das vollständige AKAP-Ht31/AKAP-Lbc und/oder eine kleinere Variante mögliche
Interaktionspartner von ERα sind.
Um AKAP-Ht31 vollständig zu erhalten (ein 4,5-kb-Fragment des 3 -Endes
existierte bereits), wurde das 5 -Ende seiner Nukleotidsequenz aus einer
humanen Nieren-cDNA-Expressionsbibliothek (Stratagene, Heidelberg) kloniert.
Aus dem vollständigen wildtypischen Klon von AKAP-Ht31/AKAP-Lbc wurden die
klassische Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-RII), die nicht-
kanonische (zweite) Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-2.RII) und die
Pleckstrin-homology und Dbl-homology (DHPH-) Domäne als GFP-Konstrukte
kloniert.
de
dc.description.abstract
AKAP-Ht31/AKAP-Lbc belongs to the family of the A kinase anchoring proteins.
This AKAP shows an ubiquitous distribution, interacts with many different
physiological relevant proteins and is involved in a number of regulatory
processes within the cell.
Anti-AKAP-Ht31/AKAP-Lbc-antibodies were tested in cross-immunoprecipitation
studies in MCF-7 cells, to characterize their specifity against AKAP-Ht31
/AKAP-Lbc splice variants. Using the Western Blot technique after
immunoprecipitation, up to nine potential AKAP-Ht31/AKAP-Lbc splice variants
with molecular weight ranging from 70 kDa till >250 kDa were detected.
In the next part of this work, AKAPs with molecular weight of 40 kDa, 60 kDa,
80 kDa and 160 kDa were enriched in MCF-7 cells using cAMP-agarose-
precipitation and subsequently detection with RII-overlay assays. Additionally
the nuclear steroid/thyroid receptor ERα had been detected in Western Blot
assays after cAMP-agarose-precipitation. This was the first hint for a complex
consisting of ERα, PKA and an AKAP.
Four potential involved AKAP-Ht31 splice variants were then identified using
again the RII-overlay technique after immunoprecipitation. Two proteins with
molecular weight >220 kDa. The bigger protein most likely represents full-
length, 309 kDa AKAP-Ht31. The smaller protein might be a new AKAP-Ht31 splice
variant or a proteolytic degradation product. The AKAP-Ht31 splice variant Brx
and a 80 kDa protein are also candidates for the interaction with ERα.
Immunofluorescence studies in MCF-7 cells showed, that at least one AKAP-Ht31
splice variant co-localizes in untreated cells with ERα and co-transports with
the receptor after E2-treatment into the nucleus.
These findings point to the possibility that full-length AKAP-Ht31 and/or a
smaller splice variant might interact with ERα.
In order to gain the full-length AKAP-Ht31/AKAP-Lbc the 5 -end was cloned
using a human kidney cDNA expression library (Stratagene, Heidelberg).
In the next part of this work, a full-length AKAP-Ht31/AKAP-Lbc construct was
used to clone the classical binding domain of PKA-RII-subunits (Ht-RII), the
potential second binding domain of PKA-RII-subunits (Ht-2.RII) and the
Pleckstrin- and Dbl-homology (DHPH-) Domain into GFP-vectors.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Estrogen Receptor
dc.subject
Signal Transduction
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Funktionelle Analyse des Proteinkinase A Ankerproteins Ht31
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Walter Rosenthal
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Hartmut Oschkinat
dc.date.accepted
2005-05-24
dc.date.embargoEnd
2006-02-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005003466
dc.title.translated
Functional Analysis of the Protein Kinase A Anchoring Protein Ht31
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001708
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/346/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001708
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access