AKAP-Ht31/AKAP-Lbc gehört zu der Familie der A kinase anchoring proteins. Es weist eine ubiquitäre Verbreitung auf und ist in seiner Interaktion mit verschiedenen anderen physiologisch relevanten Proteinen in zahlreiche regulatorische Zellprozesse eingebunden.
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst anti-AKAP-Ht31-Antikörper in Kreuz- Immunpräzipitationsstudien mit MCF-7-Zellen getestet, um ihre Spezifität gegen AKAP-Ht31-Spleißvarianten zu charakterisieren. Insgesamt konnten im Western Blot nach Immunpräzipitation bis zu neun mögliche AKAP-Ht31-Spleißvarianten mit Molekulargewichten von 70 kDa bis >250 kDa detektiert werden.
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurden AKAP-Proteine der Größen 40 kDa, 60 kDa, 80 kDa und 160 kDa in MCF-7-Zellen mittels einer cAMP-Agarose- Präzipitation angereichert und anhand des RII-overlays detektiert. Der nukleare Steroid/Thyroid-Rezeptor ERα wurde ebenfalls nach cAMP-Agarose- Präzipitation im Western Blot detektiert. Dies spricht für das Vorhandensein eines Komplexes aus einem funktionellen AKAP-Protein, daran gebundenen ERα und, über die RII-Bindungsdomäne des AKAP-Protein verankerter, PKA.
Die Identifizierung potentiell beteiligter AKAP-Ht31-Spleißvarianten nach Immunpräzipitation im RII-overlay führte zu vier Proteinen. Zwei Proteine mit einem Molekulargewicht >220 kDa, von denen das größere wahrscheinlich das gesamte AKAP-Ht31/AKAP-Lbc (309 kDa) und das kleinere eine weitere AKAP- Ht31-Spleißvariante oder ein proteolytisches Abbauprodukt darstellt. Des Weiteren kommt die AKAP-Ht31-Spleißvariante Brx und eine 80-kDa-Protein als Interaktionspartner von ERα in Frage. In Immunfluoreszenzstudien in MCF-7-Zellen konnte gezeigt werden, dass zumindest eine AKAP-Ht31-Variante in unbehandelten Zellen mit ERα kolokalisiert und nach E2-Behandlung mit dem Rezeptor in den Nukleus transloziert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vollständige AKAP-Ht31/AKAP-Lbc und/oder eine kleinere Variante mögliche Interaktionspartner von ERα sind.
Um AKAP-Ht31 vollständig zu erhalten (ein 4,5-kb-Fragment des 3 -Endes existierte bereits), wurde das 5 -Ende seiner Nukleotidsequenz aus einer humanen Nieren-cDNA-Expressionsbibliothek (Stratagene, Heidelberg) kloniert.
Aus dem vollständigen wildtypischen Klon von AKAP-Ht31/AKAP-Lbc wurden die klassische Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-RII), die nicht- kanonische (zweite) Bindedomäne der PKA-RII-Untereinheiten (Ht-2.RII) und die Pleckstrin-homology und Dbl-homology (DHPH-) Domäne als GFP-Konstrukte kloniert.
AKAP-Ht31/AKAP-Lbc belongs to the family of the A kinase anchoring proteins. This AKAP shows an ubiquitous distribution, interacts with many different physiological relevant proteins and is involved in a number of regulatory processes within the cell.
Anti-AKAP-Ht31/AKAP-Lbc-antibodies were tested in cross-immunoprecipitation studies in MCF-7 cells, to characterize their specifity against AKAP-Ht31 /AKAP-Lbc splice variants. Using the Western Blot technique after immunoprecipitation, up to nine potential AKAP-Ht31/AKAP-Lbc splice variants with molecular weight ranging from 70 kDa till >250 kDa were detected.
In the next part of this work, AKAPs with molecular weight of 40 kDa, 60 kDa, 80 kDa and 160 kDa were enriched in MCF-7 cells using cAMP-agarose- precipitation and subsequently detection with RII-overlay assays. Additionally the nuclear steroid/thyroid receptor ERα had been detected in Western Blot assays after cAMP-agarose-precipitation. This was the first hint for a complex consisting of ERα, PKA and an AKAP.
Four potential involved AKAP-Ht31 splice variants were then identified using again the RII-overlay technique after immunoprecipitation. Two proteins with molecular weight >220 kDa. The bigger protein most likely represents full- length, 309 kDa AKAP-Ht31. The smaller protein might be a new AKAP-Ht31 splice variant or a proteolytic degradation product. The AKAP-Ht31 splice variant Brx and a 80 kDa protein are also candidates for the interaction with ERα.
Immunofluorescence studies in MCF-7 cells showed, that at least one AKAP-Ht31 splice variant co-localizes in untreated cells with ERα and co-transports with the receptor after E2-treatment into the nucleus.
These findings point to the possibility that full-length AKAP-Ht31 and/or a smaller splice variant might interact with ERα.
In order to gain the full-length AKAP-Ht31/AKAP-Lbc the 5 -end was cloned using a human kidney cDNA expression library (Stratagene, Heidelberg).
In the next part of this work, a full-length AKAP-Ht31/AKAP-Lbc construct was used to clone the classical binding domain of PKA-RII-subunits (Ht-RII), the potential second binding domain of PKA-RII-subunits (Ht-2.RII) and the Pleckstrin- and Dbl-homology (DHPH-) Domain into GFP-vectors.
