Charakterisierung der humanen Glukosylceramid-Synthase in melanozytären Zellen

Abstract

Das maligne Melanom zeichnet sich durch eine sehr hohe Chemotherapie-Resistenz aus. Neben der Überexpression von anti-apoptotischen Proteinen wie Bcl-2, sind mittlerweile auch Enzyme des Lipidstoffwechsels beschrieben, die eine Resistenz bei Krebszellen auslösen können. Lavie et al. (1996), konnten erstmals zeigen, daß die Aktivität der Glukosylceramid-Synthase mit der Adriamycin-Resistenz von MCF-7Adr-Brustkrebszellen zusammenhängt (Lucci et al., 1998). Für das maligne Melanom liegen bislang keine Daten über diesen Resistenz-Mechanismus und über die Glukosylceramid-Synthase vor. Ich habe in meiner Arbeit die Glukosylceramid-Synthase in Melanomzellen charakterisiert und ihre Expression und In-vitro-Aktivität mit primären humanen Melanozyten verglichen. Zusätzlich wurde noch der Einfluß der Überexpression des Enzyms auf das Apoptoseverhalten der humanen Melanomzellinie Bro untersucht. Die Charakterisierung der Glukosylceramid-Synthase hat gezeigt, daß es sich in der humanen Melanomzellinie Mel-HO um ein Membranprotein handelt, dessen Aktivität durch die Menge an Protein und die Konzentration der eingesetzten Substrate beeinflußt werden kann. Zusätzlich, spielt auch die chemische Struktur des Ceramids eine Rolle. Der Vergleich von vier unterschiedlichen Ceramid-Analoga mit natürlichem Ceramid hat gezeigt, daß neben dem natürlichen Ceramid nur C8-Ceramid als Substrat geeignet ist. Kurzkettige Analoga, sowie Dihydroceramid-Analoga zeigten keinen In-vitro-Umsatz. Für die Untersuchungen der Proteinexpression in Melanomzellen und Melanozyten wurde ein peptidspezifischer Antikörper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antikörpers wurde gezeigt, daß die Glukosylceramid-Synthase in primären Melanozyten und Melanomzellen unterschiedlich exprimiert ist. Melanomzellen wiesen dabei eine stärkere Expression und daraus resultierend auch eine stärkere Aktivität der Glukosylceramid-Synthase auf. Die höhere Aktivität der Glukosylceramid- Synthase in der Melanomzellen führt dabei zu einem Anstieg an Glykosphingolipiden. Um den Einfluß der Glukosylceramid-Synthase auf die Apoptose-Resistenz von Melanomzellen zu untersuchen, habe ich das Enzym in Bro-Melanomzellen stabil überexprimiert und anschließend die Apoptoserate der Zellen gemessen. Dabei konnte ich keinen anti-apoptotischen Effekt nachweisen. Genauso wie in Mel-HO-Melanomzellen, kommt es auch hier zu einem Anstieg des Glycosphingolipid-Pools. Ich habe in meiner Arbeit gezeigt, daß die Glukosylceramid-Synthase in primären Melanozyten und Mel-HO-Melanomzellen unterschiedlich reguliert wird. Im Gegensatz zu veröffentlichten Daten über Brustkrebszellen, konnte ich keinen Einfluß der Glukosylceramid-Synthase auf die Chemotherapieresistenz des malignen Melanoms zeigen.

One of the major problems in the therapy of malignant melanoma is the multi drug resistance of this skin tumor. In the last few years it has been shown that in addition to anti apoptotic proteins like Bcl-2, also several lipids are also involved in the resistance (Ramu et al., 1984; Hakomori, 1993). Lavie et al. (1996), showed that the activity of the glucosylceramide synthase is responsible for adriamycin resistance in MCF-7Adr breast cancer cells. Up to now no Data about this mechanism and about glucosylceramide synthase are available in human malignant melanoma. In the present study I characterized the glucosylceramid synthase in human melanoma cells and compared its expression and in vitro activity to primary human melanocytes. Furthermore, I stably overexpressed the enzyme in the human melanoma cell line Bro and examined the anti-apoptotic influence of this overexpression. Cell fractionation studies of glucosylceramide synthase showed that the enzyme was found in a membrane fraction. In vitro activity depends on protein-, UDP- glucose- and ceramide-concentrations. Furthermore the structure of ceramides used is of great importance. I was able to show that only C8-Ceramide and natural ceramide are suitable substrates. Short chain ceramide analogues and dihydro-ceramide analogues are only poor substrates. To examine the protein expression in primary melanocytes and human melanoma cells a peptide specific polyclonal antibody was generated. Using this antibody I was able to show that glucosylceramide synthase showed higher protein expression in Mel-HO melanoma cells which correlates to the higher activity of glucosylceramide synthase in this cell line. Comparison studies on total cellular lipids between melanocytes and Mel-HO melanoma cells did not show an accumulation of glucosylceramide in melanoma cells but a higher amount of more complex glycosphingolipids. To examine the effect of glucosylceramide synthase on the apoptotic behaviour of melanoma cells glucosylceramid synthase overexpressing cells (MK12) were generated. In contrast to published results in breast cancer cells I was not able to detect an anti-apoptotic effect of glucosylceramide in these cells. Correlating to the results of Mel-HO melanoma cells MK12 cells did also show an accumulation of gangliosides. I was able to show the different regulation of melanoma cells and primary human melanocytes in this study. In contrast to published results in breast cancer cells I was not able to detect a connection between glucosylceramide and apoptosis resistance of malignant melanoma.