id,collection,dc.contributor.author,dc.contributor.firstReferee,dc.contributor.furtherReferee,dc.contributor.gender,dc.date.accepted,dc.date.accessioned,dc.date.available,dc.date.embargoEnd,dc.date.issued,dc.description,dc.description.abstract[de],dc.description.abstract[en],dc.identifier.uri,dc.identifier.urn,dc.language,dc.rights.uri,dc.subject,dc.subject.ddc,dc.title,dc.title.translated[en],dc.type,dcterms.accessRights.dnb,dcterms.accessRights.openaire,dcterms.format[de],refubium.affiliation[de],refubium.mycore.derivateId,refubium.mycore.fudocsId,refubium.mycore.transfer "94ef79bd-ff37-4907-ab8f-81cd2cd45cfd","fub188/14","Barz, Steffen","Prof. Dr. Dr. Christoph C. Geilen","Prof. Dr. Volker Erdmann","n","2003-12-01","2018-06-07T23:00:44Z","2003-12-08T00:00:00.649Z","2003-12-09","2003","0 Titelblatt und Inhalt 1 Einleitung 1 1.1 Das maligne Melanom 1 1.2 Sphingolipide 1 1.2.1 Struktur und Biosynthese der Sphingolipide 2 1.3 Glykosphingolipide 4 1.3.1 Die Biosynthese komplexer Ganglioside 5 1.4 Die UDP-Glukose:Ceramid-Glukosyltransferase 7 1.5 Biologische Funktionen von (Glyko-)Sphingolipiden 10 1.5.1 Sphingolipide und Apoptose 11 1.5.2 Rolle der Sphingolipide in der Haut 18 1.6 Pathobiochemie der (Glyko-)Sphingolipide 24 1.6.1 Sphingolipide und Krebs 24 1.6.2 Sphingolipidosen 26 1.7 Zielsetzung der Arbeit 29 2 Ergebnisse 30 2.1 Subzelluläre Lokalisation der Glukosylceramid-Synthase 30 2.2 Einfluß der Proteinmenge auf die In-vitro-Aktivität der Glukosylceramid- Synthase 31 2.3 Abhängigkeit der Substratmenge auf die In-vitro-Aktivität der Glukosylceramid-Synthase 32 2.4 Substratspezifität der Glukosylceramid-Synthase für verschiedene Ceramide 34 2.5 Einfluß von verschiedenen Nukleotiden auf die In-vitro-Aktivität der Glukosylceramid-Synthase 35 2.6 Spezifität des peptidspezifischen anti-humane Glukosylceramid-Synthase- Antikörpers SA-7061 36 2.7 Medium-abhängige Aktivität der Glukosylceramid-Synthase 38 2.8 Expression der Glukosylceramid-Synthase in der humanen Melanomzellinie Mel-HO und primären humanen Melanozyten 38 2.9 Vergleich der In-vitro-Aktivität der Glukosylceramid-Synthase von verschiedenen humanen Melanomzellen und Melanozyten 40 2.10 Chromatographische Auftrennung von Lipiden in Mel-Ho-Melanomzellen und primären humanen Melanozyten 42 2.11 Einfluß von Bcl-2 auf die In-vitro-Aktivität der Glukosylceramid-Synthase 43 2.12 Schaltbare Überexpression der Glukosylceramid-Synthase in Bro- Melanomzellen 44 2.12.1 Klonierung der humanen Glukosylceramid-Synthase 44 2.12.2 Transiente Überexpression der humanen Glukosylceramid-Synthase 45 2.12.3 Stabile Überexpression der Glukosylceramid-Synthase 46 2.13 Einfluß der Überexpression der Glukosylceramid-Synthase auf die Apoptoserate 50 2.14 Einfluß von d,l-threo-1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PPPP) auf das Wachstum der humanen Melanomzellinie Mel-HO 53 2.15 Hemmung der Glukosylceramid-Synthase durch d,l‑threo-1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PPPP) 54 3 Diskussion 56 3.1 Charakterisierung der humanen Glukosylceramid-Synthase in der humanen Melanomzellinie Mel-HO 57 3.2 Expression und In-vitro-Aktivität der humanen Glukosylceramid-Synthase in verschiedenen humanen Melanomzellinien und primären humanen Melanozyten 59 3.3 Schaltbare Überexpression der Glukosylceramid-Synthase in Bro- Melanomzellen 63 3.4 Einfluß des Glukosylceramidsynthase-Inhibitors d,l-threo-1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-pyrrolidino-1-propanol (PPPP) 67 3.5 Schlußfolgerungen und Ausblick 69 4 Zusammenfassungen 73 4.1 Zusammenfassung 73 4.2 Summary 75 5 Material 77 5.1 Chemikalien 77 5.2 Verbrauchsmaterialien 78 5.3 Zellkulturmaterialien 79 5.4 Zellen 80 5.4.1 Zellinien 80 5.4.2 Primäre Zellen 80 5.5 Antikörper 80 5.6 Primer 80 5.7 Gene 81 5.8 Vektoren 81 5.9 Geräte 82 6 Methoden 84 6.1 Zellkultur 84 6.1.1 Zellkulturmedien und Lösungen 84 6.1.2 Präparation primärer humaner Melanozyten 86 6.1.3 Kultivierung der Zellen 87 6.1.3.1 Kultivierung humaner Melanomzellen 87 6.1.3.2 Zellkultur primärer humaner Melanozyten 87 6.1.3.3 Kultivierung von transfizierten humanen Melanomzellen 88 6.1.3.4 Kontrolle der Genexpression in transfizierten Melanomzellen 88 6.1.4 Einfrieren und Auftauen der Melanomzellen 88 6.2 Bakterien 89 6.2.1 Benötigte Lösungen und Medien 89 6.2.2 Anzucht transformierter Escherichia coli DH5a Zellen 90 6.2.3 Einfrieren und Auftauen von E. coli DH5a 90 6.3 Zellbiologie 90 6.3.1 Messung der Proliferation 90 6.3.2 Bestimmung der Zytotoxizität 92 6.3.3 Nachweis der Apoptose 93 6.4 Lipidchemie 94 6.4.1 Vesikelformierung für den In-vitro-UDP-Glukose:Ceramid-Glukosyl- transferase-Assay 94 6.4.2 Isolierung und Auftrennung zellulärer Lipide 95 6.4.2.1 Isolierung von zellulärem Gesamt-Lipid 95 6.4.2.2 Auftrennung und Nachweis zellulärer Lipide 95 6.5 Enzymreaktionen 96 6.5.1 Messung der UDP-Glukose:Ceramid-Glukosyltransferase-Aktivität 96 6.6 Proteinchemie 97 6.6.1 Peptid-ELISA 97 6.6.2 Isolierung zellulärer Proteine und subzelluläre Isolierung 99 6.6.3 Bestimmung der Proteinkonzentration 100 6.6.4 Diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese 101 6.6.5 Western Blot 104 6.6.6 Immuno-Nachweis geblotteter Proteine 105 6.7 Molekularbiologie 107 6.7.1 Isolierung von Nukleinsäuren 107 6.7.1.1 Isolierung von Gesamt-RNA 107 6.7.1.2 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen 108 6.7.1.3 Plasmidpräparation im Großmaßstab 108 6.7.1.4 Plasmidpräparation im Kleinmaßstab 109 6.7.1.5 Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration 110 6.7.2 Enzymkatalysierte Reaktionen 110 6.7.2.1 Restriktion von DNA 110 6.7.2.2 Dephosphorylierung der 5'-Enden von DNA 111 6.7.2.3 Ligation von DNA-Fragmenten 111 6.7.3 Klonierung der humanen UDP-Glukose:Ceramid-Glukosyltransferase 111 6.7.4 Transformation kompetenter Escherichia coli DH5a-Zellen 112 6.7.5 Polymerase-Kettenreaktion 112 6.7.6 Agarose-Gel Elektrophorese 114 6.7.7 Transfektion von humanen Melanomzellen mit dem schaltbaren Vektorsystem pTet-On 115 7 Literatur 117 8 Abkürzungen 131 9 Veröffentlichungen 133 Curriculum Vitae I Danksagung II","Das maligne Melanom zeichnet sich durch eine sehr hohe Chemotherapie-Resistenz aus. Neben der Überexpression von anti-apoptotischen Proteinen wie Bcl-2, sind mittlerweile auch Enzyme des Lipidstoffwechsels beschrieben, die eine Resistenz bei Krebszellen auslösen können. Lavie et al. (1996), konnten erstmals zeigen, daß die Aktivität der Glukosylceramid-Synthase mit der Adriamycin-Resistenz von MCF-7Adr-Brustkrebszellen zusammenhängt (Lucci et al., 1998). Für das maligne Melanom liegen bislang keine Daten über diesen Resistenz-Mechanismus und über die Glukosylceramid-Synthase vor. Ich habe in meiner Arbeit die Glukosylceramid-Synthase in Melanomzellen charakterisiert und ihre Expression und In-vitro-Aktivität mit primären humanen Melanozyten verglichen. Zusätzlich wurde noch der Einfluß der Überexpression des Enzyms auf das Apoptoseverhalten der humanen Melanomzellinie Bro untersucht. Die Charakterisierung der Glukosylceramid-Synthase hat gezeigt, daß es sich in der humanen Melanomzellinie Mel-HO um ein Membranprotein handelt, dessen Aktivität durch die Menge an Protein und die Konzentration der eingesetzten Substrate beeinflußt werden kann. Zusätzlich, spielt auch die chemische Struktur des Ceramids eine Rolle. Der Vergleich von vier unterschiedlichen Ceramid-Analoga mit natürlichem Ceramid hat gezeigt, daß neben dem natürlichen Ceramid nur C8-Ceramid als Substrat geeignet ist. Kurzkettige Analoga, sowie Dihydroceramid-Analoga zeigten keinen In-vitro-Umsatz. Für die Untersuchungen der Proteinexpression in Melanomzellen und Melanozyten wurde ein peptidspezifischer Antikörper hergestellt. Mit Hilfe dieses Antikörpers wurde gezeigt, daß die Glukosylceramid-Synthase in primären Melanozyten und Melanomzellen unterschiedlich exprimiert ist. Melanomzellen wiesen dabei eine stärkere Expression und daraus resultierend auch eine stärkere Aktivität der Glukosylceramid-Synthase auf. Die höhere Aktivität der Glukosylceramid- Synthase in der Melanomzellen führt dabei zu einem Anstieg an Glykosphingolipiden. Um den Einfluß der Glukosylceramid-Synthase auf die Apoptose-Resistenz von Melanomzellen zu untersuchen, habe ich das Enzym in Bro-Melanomzellen stabil überexprimiert und anschließend die Apoptoserate der Zellen gemessen. Dabei konnte ich keinen anti-apoptotischen Effekt nachweisen. Genauso wie in Mel-HO-Melanomzellen, kommt es auch hier zu einem Anstieg des Glycosphingolipid-Pools. Ich habe in meiner Arbeit gezeigt, daß die Glukosylceramid-Synthase in primären Melanozyten und Mel-HO-Melanomzellen unterschiedlich reguliert wird. Im Gegensatz zu veröffentlichten Daten über Brustkrebszellen, konnte ich keinen Einfluß der Glukosylceramid-Synthase auf die Chemotherapieresistenz des malignen Melanoms zeigen.","One of the major problems in the therapy of malignant melanoma is the multi drug resistance of this skin tumor. In the last few years it has been shown that in addition to anti apoptotic proteins like Bcl-2, also several lipids are also involved in the resistance (Ramu et al., 1984; Hakomori, 1993). Lavie et al. (1996), showed that the activity of the glucosylceramide synthase is responsible for adriamycin resistance in MCF-7Adr breast cancer cells. Up to now no Data about this mechanism and about glucosylceramide synthase are available in human malignant melanoma. In the present study I characterized the glucosylceramid synthase in human melanoma cells and compared its expression and in vitro activity to primary human melanocytes. Furthermore, I stably overexpressed the enzyme in the human melanoma cell line Bro and examined the anti-apoptotic influence of this overexpression. Cell fractionation studies of glucosylceramide synthase showed that the enzyme was found in a membrane fraction. In vitro activity depends on protein-, UDP- glucose- and ceramide-concentrations. Furthermore the structure of ceramides used is of great importance. I was able to show that only C8-Ceramide and natural ceramide are suitable substrates. Short chain ceramide analogues and dihydro-ceramide analogues are only poor substrates. To examine the protein expression in primary melanocytes and human melanoma cells a peptide specific polyclonal antibody was generated. Using this antibody I was able to show that glucosylceramide synthase showed higher protein expression in Mel-HO melanoma cells which correlates to the higher activity of glucosylceramide synthase in this cell line. Comparison studies on total cellular lipids between melanocytes and Mel-HO melanoma cells did not show an accumulation of glucosylceramide in melanoma cells but a higher amount of more complex glycosphingolipids. To examine the effect of glucosylceramide synthase on the apoptotic behaviour of melanoma cells glucosylceramid synthase overexpressing cells (MK12) were generated. In contrast to published results in breast cancer cells I was not able to detect an anti-apoptotic effect of glucosylceramide in these cells. Correlating to the results of Mel-HO melanoma cells MK12 cells did also show an accumulation of gangliosides. I was able to show the different regulation of melanoma cells and primary human melanocytes in this study. In contrast to published results in breast cancer cells I was not able to detect a connection between glucosylceramide and apoptosis resistance of malignant melanoma.","https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9930||http://dx.doi.org/10.17169/refubium-14128","urn:nbn:de:kobv:188-2003003207","ger","http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen","glucosylceramide-synthase||melanoma||apoptosis||gangliosides||melanocytes","600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::610 Medizin und Gesundheit","Charakterisierung der humanen Glukosylceramid-Synthase in melanozytären Zellen","Characterization of human glucosylceramide synthase in melanocytic cells","Dissertation","free","open access","Text","Biologie, Chemie, Pharmazie","FUDISS_derivate_000000001134","FUDISS_thesis_000000001134","http://www.diss.fu-berlin.de/2003/320/"