For dog breeders as well as for veterinarians the aim of a semen evaluation is to give a prognosis about the fertilizing capacity of a semen sample. Conventional semen analysis includes determination of volume, color, sperm concentration, progressive sperm motility, sperm membrane integrity and sperm morphology. Besides, several additional parameters have been evaluated like the hypo-osmotic swelling test (HOS test). The HOS test is an easily applicable test to assess the functional integrity of the plasma membrane of sperm cells. The overall objectives of this thesis were to analyse relationships between HOS test results and conventional semen parameters before freezing and after thawing and to determine the diagnostic value of the HOS test as a standard procedure for canine semen evaluation. In preparation for the clinical trial, a systematic literature review was conducted in order to evaluate the quality of published literature concerning the HOS test. Using two databases, 354 articles were found. Out of these, 38 articles were eligible for further analyses according to specific quality parameters such as randomization, blinding, inter- and intraobserver agreement and sample size. Also test characteristics, such as study design, population, semen sampling and implementation concerning the HOS test were investigated. A citation map was developed to identify the origin of the quotation of the HOS test. Although there were numerous articles available, the diagnostic value of the HOS test remained unclear. Until then, neither a recognized test implementation nor reliable reference values have been defined. Most of the trials evaluated showed serious methodological flaws and therefore did not permit drawing reliable conclusions. According to our results, approximately half of the studies (n = 20) included a sample size of five or less animals. None of the studies examined the inter- or intraobserver agreement for the HOS test. Overall, the results of the study indicated the need for standardization of test implementations as well as for reliable reference values. Furthermore, a possible correlation between the HOS test results and the fertilizing capacity will have to be clarified to determine the diagnostic value of the HOS test. The objectives of the second study were 1) to examine relationships between HOS test results and conventional semen parameters before freezing and after thawing and 2) to evaluate the prognostic value of the HOS test results on the post-thaw quality of canine semen. Semen of 35 dogs was collected and analysed before freezing and after thawing following a 7-day freeze-thaw interval. Conventional semen variables such as sperm cell motility, membrane integrity and morphology were evaluated and also the HOS test was conducted. For the prediction of individual cryopreservation capacity, semen was classified into good and poor quality according to certain semen characteristics. Results from the assessment of fresh semen parameters of good and poor semen quality were statistically compared. Based on these results, it is not possible to predict the quality of frozen-thawed dog semen using the HOS test. The objective of the third experiment was to examine time-dependent changes of motility after thawing cryopreserved canine semen. Semen motility is expressed as the percentage of total motile or progressive motile sperm cells. It is usually estimated by visual inspection using a light contrast microscope at X 100 at 37°C immediately after semen collection or immediately after thawing frozen semen and should be one of the first steps of a semen analysis. Standard operating procedures, however, have never been established for this test. For this experiment, semen of 35 dogs was collected and volume, concentration, progressive motility, morphology, membrane integrity and HOS test were evaluated. For cryopreservation CaniPRO® Freeze A&B was used. Semen was thawed and diluted using CaniPRO® Culture Medium. After thawing, semen was evaluated as before. In addition, every sample was tested for progressive motile sperm cells 0, 5, 20 and 60 minutes after thawing. Overall, the study revealed significant positive correlations between progressive motility and conventional semen parameters, which were highest five minutes after thawing. To obtain comparable results for motility assessment of cryopreserved canine semen, the development of standard operating procedures was recommended. The presented three studies indicate the need for standardization of test implementations as well as for reliable reference values to warrant the comparability of information about semen quality. Although significant correlations were found between the HOS test results and conventional semen parameters, the HOS test is not suitable to give a prognosis about the quality of frozen-thawed canine semen.
Sowohl für Hundezüchter als auch für Tierärzte ist es wünschenswert, im Rahmen einer Samenanalyse die Befruchtungsfähigkeit prognostizieren zu können. Eine Samenanalyse beinhaltet in der Regel die Bestimmung von Volumen, Farbe, Spermienkonzentration, Spermienbeweglichkeit, Membranintegrität sowie Spermienmorphologie. Darüber hinaus gibt es zahlreiche zusätzliche Untersuchungsmöglichkeiten, wie beispielsweise den Hypo-osmotischen Schwelltest (HOSTest). Der HOS-Test ist ein einfach zu handhabener Test, um die funktionelle Integrität der Plasmamembranen von Spermienzellen zu bestimmen. Ziel dieser Arbeit war es, die Beziehung zwischen den Ergebnissen des HOS-Tests und herkömmlichen Spermienparametern vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen zu untersuchen, um die diagnostische Wertigkeit des HOS-Tests als Standardparameter der caninen Samenanalyse zu bestimmen. In Vorbereitung auf eine klinische Studie wurde zunächst eine systematische Literaturübersicht angefertigt, um die Qualität von Publikationen in Bezug auf den HOS-Test zu bewerten. Mit Hilfe zweier Datenbanken wurden 354 Artikel ausfindig gemacht, von denen im Ergebnis 38 Artikel den Anforderungen entsprachen und anschließend analysiert wurden. Die Qualität der Studien wurde nach spezifischen Parametern, wie der Durchführung von Randomisierung, Verblindung, Inter- und Intraobservervariabilität und der Probandengröße systematisch bewertet. Zusätzlich wurden weitere Testcharakteristika, wie das Studiendesign, die Population, das Verfahren der Samengewinnung und die Spezifika der Anwendung des HOS-Tests erhoben. Um den Ursprung der literarischen Zitate in Bezug auf den HOS-Test zu ermitteln, wurde eine Citation Map angefertigt. Obwohl zahlreiche Studien zu diesem Thema publiziert wurden, konnte die diagnostische Wertigkeit des HOS-Tests nicht abschließend definiert werden. In keiner der untersuchten Studien wurden standardisierte Testparameter oder Referenzwerte für den HOS-Test festgelegt. Die meisten Studien wiesen erhebliche methodologische Mängel auf und ließen deshalb keine verlässlichen Schlussfolgerungen zu. Nach unseren Ergebnissen wurden ca. die Hälfte der untersuchten Studien (n=20) mit einer Population von fünf oder gar weniger Tieren durchgeführt. In keiner der Studien wurde die Inter- oder Intraoberservervariabilität für den HOS-Test untersucht. Insgesamt wiesen die Ergebnisse der Studie auf die Notwendigkeit hin, Testverfahren zu standardisieren und verlässliche Referenzwerte festzulegen. Um die diagnostische Wertigkeit des HOS-Tests zu bestimmen, muss in künftigen Studien die Beziehung zwischen dem HOS-Test und der Befruchtungsfähigkeit geklärt werden. Ziel der zweiten Studie war es, die Voraussagbarkeit der Qualität von aufgetautem Tiefgefriersamen von Hunden anhand der Ergebnisse des HOS-Tests im Frischsamen zu bestimmen. Dazu wurden zunächst die statistischen Beziehungen zwischen den Ergebnissen des HOS-Tests zu herkömmlichen Spermienparametern vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen untersucht. Hierfür wurde Samen von 35 Hunden gewonnen. Der Samen wurde vor dem Einfrieren und nach einem siebentägigen Einfrier-Auftau-Intervall untersucht. Neben der Bestimmung herkömmlicher Spermienparameter, wie Spermienbeweglichkeit, Membranintegrität und Morphologie wurde der HOS-Test durchgeführt. Zur Bestimmung der individuellen Einfrierbarkeit einer Spermienprobe wurden diese anhand der Untersuchungsergebnisse nach dem Auftauen im Nachhinein unterteilt in Proben, welche den mindestanforderungen entsprachen, und solche, deren Werte darunter lagen. Die Ergebnisse der Frischsamenuntersuchung der so eingeteilten Proben wurden statistisch miteinander verglichen. Demnach zeigte sich, dass es nicht möglich ist, die Qualität von aufgetautem Tiefgefriersamen mit Hilfe der Ergebnise des HOS-Tests von Frischsamen vorauszusagen. Ziel der dritten Studie war es, im aufgetauten Tiefgefriersamen von Hunden zeitlich abhängige Änderungen in der Spermienbeweglichkeit zu untersuchen. Die Vorwärtsbeweglichkeit wird als prozentualer Anteil angegeben. Für gewöhnlich wird die Beweglichkeit mit Hilfe eines Kontrastmikroskops mit einer 100-fachen Vergrößerung durch visuelle Inspektion bei einer Temperatur von 37°C ermittelt. Die Beweglichkeit sollte als erster Schritt der Samenuntersuchung entweder unmittelbar nach der Samenkollektion oder unmittelbar nach dem Auftauen von Tiefgefriersamen untersucht werden. Standardisierte Verfahren für diesen Test sind bisher jedoch nicht veröffentlicht worden. Für dieses Experiment wurde der Samen von 35 Hunden gewonnen und hinsichtlich Volumen, Spermienkonzentration, Vorwärtsbeweglichkeit, Spermienmorphologie, Membranintegrität untersucht. Zusätzlich wurde der HOS-Test durchgeführt. Für die Kryokonservierung wurde CaniPRO® Freeze A&B verwendet. Der Samen wurde aufgetaut und verdünnt mit Hilfe von CaniPRO® Culture Medium. Nach dem Auftauen wurde der Samen wie zuvor analysiert. Zusätzlich wurde jede Probe auf Vorwärtsbeweglichkeit 0 (T0), 5 (T5), 20 (T20) und 60 (T60) Minuten nach dem Auftauprozess untersucht. Die Ergebnisse zeigten positive Korrelationen zwischen der Vorwärtsbeweglichkeit und anderen herkömmlichen Spermienparametern auf. Diese waren fünf Minuten nach dem Auftauen der Probe am höchsten. Daraus lässt sich ableiten, dass standardisierte Testverfahren entwickelt werden sollten, um vergleichbare Ergebnisse für die Bestimmung der Spermienbeweglichkeit von aufgetautem Tiefgefriersamen zu erhalten. Die vorliegenden drei Studien heben die Notwendigkeit hervor, Testverfahren zu standardisieren und valide Referenzwerte zu ermitteln, um die Vergleichbarkeit von Informationenen über die Qualität einer Samenprobe zu gewährleisten. Obwohl signifikante Korrelationen zwischen dem HOS-Test und herkömmlichen Spermienparametern in den Studien nachgewiesen werden konnten, wird der HOS- Test als ungeeignet eingeschätzt, eine Prognose über die Qualität von aufgetautem Tiefgefriersamen von Hunden abzugeben.