Hypothermie und Kardioplegie sind seit den 1950er Jahren bedeutende Methoden in der Herzchirurgie. Die genauen zellulären Mechanismen der Kardioprotektion sind jedoch nach wie vor weitgehend ungeklärt und Bestandteil aktueller Forschung. Das Ziel der hier vorgelegten Arbeit war es, die zugrunde liegenden Mechanismen der Hypothermie-induzierten Kardioprotektion während Phasen des oxidativen Stresses in einem Kardiomyozyten-Zellkulturmodell zu untersuchen. Zellen der Ratten-Kardiomyozytenzelllinie H9c2 wurden in Analogie zu dem klinischen Prozedere gekühlt und wiedererwärmt: von 37°C auf 20°C, belassen der Zellen bei 20°C für 20 Minuten (währenddessen Schädigung mit 2 mM H2O2 und Administration der Kardioplegielösung), anschließende Wiedererwärmung auf 37°C. Daraufhin analysierten wir die Ausschüttung der Laktatdehydrogenase, die Konzentrationen reaktiver Sauerstoffspezies, die intrazelluläre ATP-Produktion und die Aktivität der mitochondrialen Reduktase, die Expression apoptoseassoziierter Signalmoleküle (Bax, Caspase-9, Caspase-3, AIF), DNA- Schädigungsmarker (H2AX, PARP-1, p53, M30 CytoDeath-Färbung) und die Expression zytoprotektiver Moleküle (ERK, Bcl-2, Akt, Hsp 32). Hypothermie verringerte die H2O2-induzierte Apoptose in Kardiomyoyzten, was sich in einer geringeren LDH-Ausschüttung, einer geringeren Caspase-9 und Caspase-3 Spaltung und einer verminderten Färbung der Cytokeratine zeigte. Zusätzlich konnte Hypothermie eine Verringerung der AIF- und p53-Expression bewirken. Nach der Wiedererwärmung waren gekühlte und wiedererwärmte Zellen besser in der Lage, ROS zu eliminieren. Zusätzlich waren die Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase und der ATP-Gehalt nach Kühlung während des oxidativen Stresses signifikant höher als in den normothermen Zellen. Hypothermie erhöhte signifikant die Expression zytoprotektiver Signalmoleküle wie Bcl-2, Akt und Hsp-32. Ebenso konnte Hypothermie die DNA-Schädigung, dargestellt in der Expression von H2AX, p53 und PARP-1, signifikant verringern. Die Effekte der Kardioplegielösung allein oder in Kombination mit Hypothermie nach H2O2-induziertem oxidativen Stress erbrachten unterschiedliche Ergebnisse. Wir konnten zeigen, dass Hypothermie und kalte Kardioplegielösung in Kombination im Vergleich zur normothermen Gruppe positive Effekte auf das Zellüberleben zeigten. Die Reduktion der frühen ERK-Aktivität mit nachfolgender Phophorylierung des Akt-Survivalproteins sprechen wie die Hochregulation der Bcl-2-Expression und die Reduktion der Bax-Expression, einhergehend mit einer verringerten Caspase-3-Aktivität, für eine kardioprotektive Wirkung kalter Kardioplegielösung. Auch konnte eine geringere Phosphorylierung von H2AX nachgewiesen werden. Kalte kristalloide Kardioplegielösung führte in den Zellen, die bei 37°C mit H2O2 geschädigt wurden, zu einem signifikanten Anstieg des Zelltodes, einem Verlust der Mitochondrienfunktion (ATP-Produktion und Aktivität der mitochondrialen Dehydrogenase), typischen morphologischen Apoptosemerkmalen und der Erhöhung proapoptotischer Signalmoleküle (Bax, Caspase-9). Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Hypothermie Kardiomyozyten während H2O2-vermitteltem oxidativen Stress durch eine Hemmung mitochondrialer Dysfunktionen und die Hemmung früher DNA-Schädigung vor Apoptose schützt. Die Kombination von Hypothermie und Kardioplegie während oxidativem Stress erbrachte keine signifikante Verbesserung der Zellvitalität und Aktivität. Die Gabe von kalter Kardioplegielösung während der Stimulation der Zellen mit H2O2 bei 37°C führte zu einem gesteigerten Verlust der Zellvitalität.
Hypothermia and cardioplegia are both standard methods for organ protection during heart surgery but the underlying basic mechanisms still remain mostly unclear and represent objects of current research activities. The purpose of our study was to investigate the mechanisms of hypothermia-induced cardioprotection during oxidative stress in a cardiomyocyte cell culture model. For hypothermic treatment we cooled H9c2 cardiomyocytes to 20°C, maintained 20 min at 20°C during which short-term oxidative damage was inflicted with 2 mM H2O2, followed by rewarming to 37°C. Later on, we analyzed lactate dehydrogenase (LDH), caspase-9 and -3 cleavage, reactive oxygen species (ROS), mitochondrial activity, intracellular ATP production, cytoprotective signaling molecules (Bcl-2, Akt protein, Hsp-32) as well as DNA damage (H2AX, p53 and PARP-1 activity). Hypothermia significantly decreased H2O2 damage in cardiomyocytes as demonstrated in a lower LDH release, less caspase-3 cleavage and less M30 CytoDeath staining. After rewarming, H2O2 damaged cells demonstrated a significantly higher reduction rate of intracellular ROS compared to normothermic H2O2 damaged cardiomyocytes. This was in line with a significantly greater mitochondrial dehydrogenase activity and higher intracellular ATP content in cooled and rewarmed cells. Moreover, hypothermia preserved cell viability by up-regulation of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and a reduction of p53 phosphorylation. DNA damage, proven by PARP-1 cleavage and H2AX phosphorylation, was significantly reduced by hypothermia. The effects of cardioplegic solution during simulation of ischemia were different depending on the temperature. We could demonstrate that hypothermia and cardioplegic solution showed positive effects on cell viability during oxidative stress in comparison to normothermic cells although cell vitality was decreased compared to cells treated with hypothermia during oxidative stress. Early reduction of ERK activity with subsequent increased phosphorylation of Akt protein together with increased expression of Bcl-2 and reduced Bax expression with reduced Caspase-3 activity represent anti- apoptotic signaling pathways induced by hypothermia and cold cardioplegic solution. These results are in line with a reduction in the phophorylation rate of H2AX. In contrast, cold cardioplegic solution during oxidative stress led to increased cell death in normothermic cells with loss of mitochondrial function and typical morphological apoptotic features and an increase in proapoptotic signalling molecules.
