Establishment and Characterization of an In Vitro Skin Disease Model Based on Filaggrin Knock Down

Abstract

Although loss-of-function mutations of FLG are a well-known major predisposing factor for atopic dermatitis (AD) and ichthyosis vulgaris (IV), respectively, only little is known about the effects caused by the reduced expression of this protein. Experiments in patients are expensive and bring the disadvantage that the features of one single gene effect cannot be observed. Often used animal models - like the flaky tail mouse - raise ethical concerns and bring the disadvantage of species related differences in the physiology beside a different pathomechanism. In vitro skin constructs are a helpful tool to overcome these disadvantages. It is possible to study the effect of the loss- of-function in just one single gene, ethical concerns are not arising and species related differences are not given since the constructs are made from human material. In this study an in vitro skin construct based on FLG knock down cultivated for 14 days was established and characterized. Morphological abnormalities like the intra- and intercellular spongiosis or the disturbed stratum corneum development could be linked to the diminished expression of FLG. Furthermore, the impact on lipid organization and composition was evaluated. In terms of lipid composition, the most striking difference between normal and FLG knock down construct was the increase in free fatty acids, whereas only minor differences in ceramide, cholesterol and cholesterol sulfate composition were found. This is well in accordance with the evaluated increase of secretory phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA) expression found in the FLG knock down construct, which results in increased levels of free fatty acids via the "phospholipids - to - free fatty acids pathway". Moreover, a significantly increased expression of the sodium/hydrogen antiporter (NHE-1) has been found in the FLG knock down construct. Based on these findings and on the fact, that the "FLG-to-urocanic acid/pyrrolidone carboxylic acid" acidification pathway is restricted in the FLG knock down construct, a feedback mechanism between these pathways can be hypothesized: When FLG expression is reduced and therefore lower amounts of the acidifying amino acids urocanic acid and pyrrolidone carboxylic acid are produced, the NHE-1 and / or sPLA2 becomes upregulated to ensure the most possible acidic skin surface pH. For further assessment of the barrier function, skin absorption studies have been performed. Permeation of the hydrophilic model substance caffeine did not differ in the normal or FLG knock down skin construct, respectively, whereas the permeation of the lipophilic model drug testosterone was enhanced in the disease construct, indicating a disturbed barrier. This is in accordance with the disturbed lipid organization in the FLG knock down constructs, which most probably is mainly affecting the permeation of lipophilic compounds. Besides the disturbed barrier, a diminished inflammatory threshold in the FLG knock down construct to the standard local irritant SDS was demonstrated. Hence, the inflammatory feature of AD skin was mimicked by means of the in vitro skin construct as well. Furthermore, the suitability of the skin construct as in vitro pharmacological testing tool for the assessment of new therapeutically option has been demonstrated by the enhanced FLG expression following a supplementation with the PPARα modulator docosahexaenoic acid. By the implementation of an endothelial cell layer, a further assimilation of the in vitro skin construct to the in vivo situation could be achieved. Still, further work is needed since at the current state of development the endothelial cells seem to disturb the epidermal maturation. In conclusion, the established in vitro skin construct is a helpful tool in basic research, offers new insights into skin physiology, disease pathophysiology and offers the opportunity to evaluate new treatment options. Therefore, the established in vitro FLG knock down construct is a relevant step in the generation of a complex in vitro model of atopic dermatitis.

Funktionsverlustmutationen im Filaggrin-Gen sind bekannte Risikofaktoren für die Entwicklung einer atopischen Dermatitis (AD) oder einer Ichthyosis vulgaris (IV). Trotzdem sind die Auswirkungen, die die reduzierte Bildung des Proteins mit sich bringt, weitgehend unbekannt. Untersuchungen an Patienten direkt sind kostspielig und haben den großen Nachteil, dass andere Faktoren das Ergebnis beeinflussen und nicht die Auswirkungen eines einzelnen Gendefekts beurteilt werden können. Versuche in Tiermodellen, wie der flaky tail Maus, sind ethisch nicht immer vertretbar und haben darüber hinaus den großen Nachteil, dass zum einen die Physiologie von Tier und Mensch doch sehr unterschiedlich ist, zum anderen unterscheidet sich auch die Pathophysiologie der Krankheit. Die Entwicklung von in vitro Hautmodellen hat die Forschung deshalb einen großen Schritt weiter gebracht, da wesentliche Nachteile, die im Patienten- oder Tierversuch entstehen, überwunden sind. Mit Hilfe von Hautmodellen ist es möglich die Auswirkungen eines Funktionsverlusts in einem einzelnen Gen zu untersuchen ohne dass ethische Regeln verletzt werden. Da in vitro Hautmodelle aus humanem Material generiert werden, liegen auch keine Spezies bedingten Unterschiede vor. In der vorliegenden Arbeit wurde ein in vitro Hautmodell, in dem spezifisch das Filaggrin-Gen ausgeschaltet wurde und das für 14 Tage kultiviert wurde, etabliert und charakterisiert. Die reduzierte Expression von Filaggrin führt zu morphologischen Veränderungen, wie z.B. einer intra- und interzellulären Ödembildung sowie einer gestörten Entwicklung des Stratum corneum. Des Weiteren wurde die Organisation und Zusammensetzung der Hautlipide untersucht. Dabei wurde als größter Unterschied zwischen normalen und FLG knock down Modellen eine signifikant größere Menge an freien Fettsäuren in dem krankhaft veränderten Modell gefunden. Die Zusammensetzung der anderen Hautlipide, Ceramide, Cholesterol und Cholesterolsulfat, war dagegen nahezu gleich. Die größere Menge an freien Fettsäuren geht mit einer erhöhten Expression der sekretorischen Phospholipase A2-IIA (sPLA2-IIA) einher. Die sPLA2 sind die für die Bildung von freien Fettsäuren aus Phospholipiden wesentlichen Enzyme im Stratum corneum. Ein signifikanter Anstieg der Expression des Natrium-/Protonen-Antiporters NHE-1 in den FLG knock down in Verbindung mit der Tatsache, dass in dem FLG knock down Modell die Azidifizierung des Stratum corneums nicht über die Bildung von Urocanin- und Pyrrolidoncarbonsäure aus Filaggrin ablaufen kann, führt zu der Hypothese einer Rückkoppelung zwischen den verschiedenen Azidifizierungsmechanismen: Reduzierte Expression des Filaggrin und damit geringere Bildung von Urocanin- und Pyrrolidoncarbonsäure aus Histidin führt zu einer Hochregulation von NHE-1 und / oder sPLA2, um den physiologisch sauren Hautoberflächen pH sowit möglich aufrecht zu erhalten. Die Barrierefunktion des Hautmodells wurde anhand der Durchführung von Hautabsorptionsstudien weiter charakterisiert. Dabei wurde für die hydrophile Modellsubstanz Coffein kein Unterschied in der Permeation des normalen oder des FLG knock down Modells gefunden. Für die lipophile Modellsubstanz Testosteron hingegen wurde ein deutlicher Anstieg der Permeation durch das FLG knock down Modell verzeichnet, was ein deutlicher Hinweis auf eine gestörte Hautbarriere liefert. Die erhöhte Permeation einer lipophilen Substanz ist höchstwahrscheinlich auf die gestörte Lipidorganisation des FLG knock down Modells zurückzuführen. Neben der gestörten Hautbarriere wurde in dem FLG knock down Modell weiterhin eine geringere Schwelle gegenüber dem lokal applizierten Standardirritans SDS nachgewiesen. Folglich kann mit dem Hautmodell auch die entzündliche Komponente der atopischen Dermatitis erfolgreich dargestellt werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass das etablierte in vitro Hautmodell für die pharmakologische Testung geeignet ist und neue therapeutische Optionen mit Hilfe des Modells entwickelt werden können. Dies wurde anhand des PPARα Modulators Docosahexaensäure und dem daraus resultierenden signifikanten Anstieg der FLG Expression verdeutlicht. Die Anwendung von PPARα Modulatoren könnte eine neue Strategie in der Behandlung der atopischen Dermatitis sein. Die Implementierung einer Endothelzellschicht in das etablierte in vitro Hautmodell brachte eine noch größere Annäherung des Modells an die in vivo Situation mit sich. Nichtsdestotrotz, ist hier eine Weiterentwicklung von Nöten, da bislang die Implementierung der Endothelzellen eine Verschlechterung der epidermalen Reifung des Hautmodells mit sich bringt. Das hier etablierte in vitro FLG knock down Hautmodell ist eine erfolgreiche Grundlage für die Forschung. Mit Hilfe des Modells ist es möglich tiefere Einblicke in die Physiologie der Haut und die pathophysiologischen Zustände von Hautkrankheiten zu bekommen und neue Strategien für die Behandlung von Hautkrankheiten zu entwickeln. Das FLG knock down Modell bildet ferner den ersten Schritt in der Entwicklung eines komplexen Modells der atopischen Dermatitis.