The water channel aquaporin-2 (AQP2) resides on intracellular vesicles of renal collecting duct principal cells. Binding of antidiuretic hormone (arginine-vasopressin, AVP) to vasopressin V2 receptors on the surface of the cells induces the translocation of AQP2 into the plasma membrane and facilitates water reabsorption from primary urine. Defects preventing the insertion of AQP2 into the plasma membrane cause diabetes insipidus (DI), a disease characterized by polyuria and polydipsia. Vice versa, a predominant localization of AQP2 in the plasma membrane is also associated with diseases, e.g. the syndrome of inappropriate antidiuretic hormone secretion (SIADH), late stage heart failure or liver cirrhosis. Here a so far unidentified effect of the widely used antimycotic drug, fluconazole, on the trafficking of AQP2 is reported. Fluconazole was identified through an unbiased screening of a small molecule library. Immunofluorescence microscopic analysis showed that it induces the AQP2 translocation in an AVP-independent manner in primary cultured rat inner medullary collecting duct (IMCD) cells. Forskolin mimicks the effect of AVP by elevating cAMP levels. In IMCD cells, fluconazole enhances the forskolin-induced increase in the localization of AQP2 in the plasma membrane. A similar effect of fluconazole on the AQP2 localization was observed in wild type mice without and upon water deprivation, a condition when the AVP level is elevated. These observations are in line with the findings that fluconazole decreases the urine volume and increases urine osmolality in both normal and water-deprived mice compared with their control littermates. At the molecular level, fluconazole increases the key trigger phosphorylation of AQP2 at Ser256, increases AQP2 abundance, and reduces phosphorylation of AQP2 at Ser261. The fluconazole-induced translocation of AQP2 to the plasma membrane is associated with an inhibition of the small GTPase RhoA and a decrease in F-actin-containing stress fibers. Thus, fluconazole removes a physical barrier hindering AQP2-bearing vesicles to reach the plasma membrane. Additionally, fluconazole decreases the urine volume in mice treated with the V2 receptor blocker tolvaptan. These observations may lead to new indications for fluconazole, i.e. treatment of diabetes insipidus for enhancing water reabsorption and as co-medication with tolvaptan to prevent excessive tolvaptan-induced water loss in patients with autosomal polycystic kidney disease.
In Hauptzellen des renalen Sammelrohrs liegt der Wasserkanal Aquaporin-2 (AQP2) auf intrazellulären Vesikeln vor. Die Stimulation das Vasopressin V2 Rezeptor auf Oberfläche renalen Hauptzellen durch Bindung von antidiuretischem Hormon (Arginin-Vasopressin, AVP) induziert die Translokation von AQP2 in die Plasmamembran. Dadurch wird die Wasser-Rückresorption aus dem Primärharn verstärkt. Defekte, die den Einbau von AQP2 in die Membran verhindern, führen zu Diabetes insipidus: ein Krankheitsbild, das von Polyurie und Polydipsie geprägt ist. Umgekehrt ist eine vorwiegende Membranlokalisation ebenso pathologisch und mit Krankheiten wie dem Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion (SIADH), Herzinsuffizienz und Leberzirrhose assoziiert. Diese Arbeit befasst sich mit einem bisher unbekannten Effekt des weitverbreiteten Antimykotikums Fluconazol auf die Umverteilung von AQP2 in Hauptzellen der Niere. Fluconazol wurde im Rahmen eines Screenings niedermolekularer Verbindungen identifiziert. Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen von primär kultivierten Sammelrohrzellen der inneren Medulla von Ratten (IMCD-Zellen, inner medullary collecting duct) zeigten, dass Fluconazol die AQP2-Umverteilung AVP-unabhängig induziert. Forskolin imitiert die AVP-induzierte Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels. In IMCD-Zellen erhöht Fluconazol die Forskolin-induzierte Plasmamembran-lokalisation von AQP2. Ein ähnlicher Effekt von Fluconazol auf die AQP2-Lokalisation wurde in Wildtyp-Mäusen mit und ohne Wasserentzug beobachtet. Wasserentzug erhöht den AVP-Spiegel im Blut. Fluconazol-induzierte Umverteilung von AQP2 geht einher mit reduziertem Urinvolumen und erhöhter Urin-Osmolarität der Fluconazol-behandelten Mäuse, sowohl bei Wasserentzug als auch unter Kontrollbedingungen, im Vergleich zu Kontroll-Wurfgeschwistern. Auf molekularer Ebene erhöht Fluconazol die impulsgebende Phosphorylierung von AQP2 an Ser256, die Gesamtmenge an AQP2 und reduziert die Phosphorylierung von AQP2 an Ser261. Die Fluconazol-induzerte Umverteilung von AQP2 in die Plasmamembran ist mit der Hemmung der kleinen GTPase RhoA und einem Abbau F -Aktin-basierter Stressfasern assoziiert. Auf diese Weise reduziert Fluconazol die F-actin Barriere, die den Transport AQP2-haltiger Vesikel zur Plasmamembran behindert. Des Weiteren reduziert Fluconazol das Urinvolumen von Mäusen, die mit dem V2-Rezeptor-Blocker Tolvaptan behandelt wurden. Die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse können genutzt werden, um Fluconazol neuen Indikationen zuzuweisen. So könnte es potenziell genutzt werden, um die Wasser-Rückresorption bei Diabetes insipidus-Patienten zu steigern. Als Zusatz-Medikation zu Tolvaptan bei autosomaler polyzystischer Nierenerkrankung könnte es den Tolvaptan-vermittelten Wasserverlust verhindern.
