In dieser Studie wurden die molekularen Mechanismen der Signaltransduktion der eNOS-Aktivierung in bovinen Endothelzellen und der Vasodilatation in Aortenringen durch EGCG untersucht. Es konnte in Versuchen zur Zeitkinetik erstmals gezeigt werden, dass die Steigerung der eNOS-Aktivität bereits wenige Minuten nach EGCG-Stimulation durch die Phosphorylierung der eNOS erfolgt. Dabei werden drei der fünf eNOS-Phosphorylierungsstellen durch EGCG phosphoryliert. In weiteren Versuchen konnte die Kalziumabhängigkeit der EGCG- induzierten eNOS-Aktivierung gezeigt werden. Es wird dazu sowohl intra- als auch extrazelluläres Kalzium benötigt. Überdies ist die Anwesenheit von extrazellulärem L-Arginin notwendig. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren konnte die Beteiligung der Src-Kinase am Signaltransduktionsweg der eNOS-Aktivierung nach EGCG-Stimulation nachgewiesen werden. Sie ist oberhalb der Akt-Kinase lokalisiert. Ein Mitwirken der CaMK und der p38MAPK konnte dabei nicht bestätigt werden. Es gelang damit ein weiterer Schritt in der Aufklärung der molekularen Mechanismen der Signaltransduktionskaskade der eNOS-Aktivierung. Gi-Proteine sowie der Lamininrezeptor wurden als mögliche Rezeptoren für EGCG auf Endothelzellen untersucht. Sie sind jedoch höchstwahrscheinlich nicht in den Signaltransduktionsweg der eNOS nach EGCG- Stimulation involviert. Im Rattenaortenringmodell konnte die in vivo-Relevanz der Versuchsergebnisse belegt werden. Schon geringe, physiologisch relevante EGCG-Konzentrationen führten zur Vasorelaxation. Die Stimulation mit EGCG führte in den Aortenringen ebenso wie in den Zellkulturversuchen zu einer Induktion der eNOS-Phosphorylierung.
In this study, the molecular mechanisms of signal transduction underlying the activation of eNOS in bovine endothelial cells and the EGCG-stimulated vasodilation in aortic ring models were investigated. Kinetic experiments showed for the first time that eNOS activity was enhanced a few minutes after ECGC-stimulated phosphorylation of three out of five possible binding sites. The presence of both intra- and extracellular calcium cations and extracellular L-arginine proved to be essential for the eNOS activation process. Experiments using pharmacological inhibitors proved an involvement of Src kinase prior to Akt kinase in the signal transduction pathway for eNOS activation. CaMK and p38MAPK do not contribute. These results aid in elucidating the molecular mechanisms that determine the signal transduction pathway of eNOS activation. Gi-proteins and the laminin receptor were investigated as possible EGCG receptors in endothelial cells, but are most likely not involved in the EGCG dependent signal transduction pathway of eNOS activation. These results have major relevance in vivo since in subsequent tests the exposure of small physiologically relevant concentrations of ECGC to rat aortic rings resulted in vasorelaxation. In line with cell culture assay results, phosphorylation of eNOS was induced after stimulation with ECGC.
