Die Duchenne Muskeldystrophie (DMD) gehört zu den häufigsten erblichen Muskeldystrophien im Kindesalter. Gegenwärtig werden die Substitution von Dystrophin oder ähnlichen Proteinen sowie die Korrektur der Mutation und damit die Wiederherstellung der Dystrophinexpression als gentherapeutische Strategien verfolgt. Jedoch führt sowohl die Herstellung der Dystrophinexpression als auch die Verwendung von viralen Transfersystemen im adulten Organismus zu Reaktionen des Immunsystems. Zudem wird eine autologe ex vivo Therapie durch eine limitierte Zahl an Myoblasten eingeschränkt. Fetale und Dystrophin-Downstream Konzepte könnten Probleme der genannten Strategien umgehen bzw. sinnvoll unterstützen. Expressionsuntersuchungen in Dystrophin negativen (Dys-) Muskelzellen zeigten Veränderungen in Genen für Zellwachstum und Differenzierung. So wiesen Biopsien von DMD-Patienten ein erhöhtes Niveau an p21 mRNA auf, einem Cyklin-abhängigen Kinase-Inhibitor, der hoch reguliert das Fortschreiten der Zellen von der G1 zur S1 Phase im Zellzyklus und somit die Zellteilung inhibiert. Ein erhöhtes Niveau von p21 schränkt somit die Zielzellen für eine autologe ex vivo oder in vivo Gen- und Zelltherapie ein. Die Reduktion von p21 würde die Möglichkeit bieten das Reservoir an Myoblasten zu erhalten oder wiederherzustellen. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Etablierung der p21 Inhibition in vitro durch RNA-Interferenz. Hierfür wurden optimale Transfektionsbedingungen und funktionelle siRNAs ermittelt. Die effektiven siRNAs wurden in einem lentiviralen Vektorsystem verwendet, um einen möglichst vollständigen und stabilen p21 knockdown zu erzielen. Dies geschah für primäre humane Myoblasten und für murine C2C12 Zellen, um den Effekt der p21 Inhibition auf die Proliferation zu untersuchen. Die Austestung an murinen Zellen erlaubt die Entwicklung eines Systems für einen in vivo Versuch am mdx-Mausmodell. Zwei in humanen Myoblasten wirksame siRNAs gegen p21 kamen an Dys- Zellen zum Einsatz. Die siRNA induzierte p21 Proteinreduktion betrug 72 Stunden nach Transfektion 29% bis 78%. Die p21 Proteinreduktion resultierte in einer Proliferationssteigerung von 11% bis 47% gegenüber unbehandelten Kontrollen. Die Expression von siRNA im lentiviralen Vektor führte zu einer nachhaltigen p21 Proteinreduktion von 70% fünf Wochen nach Infektion in Zellen eines DMD Patienten. Die Proliferation der infizierten Zellen stieg um 127%. Wiederholte Infektionen von Zellen eines anderen Patienten zeigten einen Proliferationsanstieg von 35% bis 63%. Die Unterschiede in der p21-Reduktion und der Proliferationssteigerung weisen auf eine hohe Varianz des siRNA Effektes hin. Hierbei können Unterschiede im Integrationsort des lentiviralen Vektors und individuelle Schwankungen in der p21 Basisexpression eine Rolle spielen. Die p21 Inhibition verhinderte eine vollständige Differenzierung. Für murine Zellen wurde ebenfalls eine siRNA identifiziert, die nach transienter Transfektion zu einer p21 Inhibition von 61% nach 48 Stunden führte. Die abgeleitete, viral exprimierte shRNA erzielte jedoch nur eine Reduktion von 30% gegenüber Kontrollen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine stabile p21 Reduktion mittels viral vermittelter RNA- Interferenz in der Lage ist die Proliferation von Dys- Zellen zu steigen. Damit könnte der stetige Verlust von Myoblasten bei DMD Patienten eingeschränkt werden, was zum Erhalt der Zielzellen für eine Gen- und Zelltherapie führt. Weiterführende Arbeiten zur Regulation der p21 siRNA Expression müssen jedoch eine Redifferenzierung der Myoblasten sicherstellen und sich dem Infektions-bedingten Zellverlust stellen. Während eine p21 Reduktion alleine keine Ursache für eine Onkogenese zu sein scheint, müssen verbesserte retrovirale Systeme Integration-bedingte Risiken minimieren.
Duchenne Muscle Dystrophy (DMD) is one of the most common heritable muscle disorders in childhood. Dystrophine substitution or gene fixing approaches to restore dystrophine expression are currently investigated as gene therapeutic strategies. But there are still obstacles to overcome like immune response to the re-established dystrophine expression as well to viral vector systems. And autologous ex vivo therapies are limited due to the small amount of available target cells. Fetal- or dystrophine-downstream concepts could bypass or assist some problems of these strategies. Comprehensive studies on expression of dystrophine negative (dys-) myoblasts showed altered expression of genes involved in cell proliferation and differentiation. Biopsies of DMD patients showed an increased level of cyclin dependent kinase inhibitor p21 mRNA compared to dystrophine positive controls. P21 regulates the G1 S1 progression within the cell cycle. An elevated level on p21 inhibits cell proliferation and limits the potential target cells for an autologous ex vivo as well as in vivo gene or cell therapy. Therefore a reduction in p21 could help to maintain or restore the reservoir of myoblasts. In the present study a p21 inhibition by RNA-Interference was established. Optimal transfection parameters were determined and potent p21 siRNAs were identified. The influences on cell proliferation were investigated. Effective siRNAs were used in a lentiviral vector system to achieve a long lasting, inducible and complete p21 knockdown. This was done in primary human myoblasts as well as in murine c2c12 cells. This parallel approach provides the opportunity to use this strategy in vivo in the mdx mouse model. Two effective siRNAs against human p21 were used on primary dystrophine negative myoblasts. P21 protein was reduced by 29% to 79% after 72 hours after transfection and resulted in an increase in proliferation by 11% to 47% compared to untreated controls. The siRNA expressed by a lentiviral vector lead to a prolonged reduction of p21 protein by 70% of myoblasts from a dys- patient five weeks after infection. The proliferation was elevated by 127%. Infection of myoblasts from a second patient resulted in a protein reduction by 35%-63%. The p21 knockdown prevented also a complete differentiation of myoblasts. Differences in p21 basis expression, or different integration sites of the lentiviral vector could be the reason for observed variances in the effect of siRNA inhibition. The p21 knockdown prevented also a complete differentiation of myoblasts. Additionally effective siRNAs for tests on murine myoblasts were identified. After transient transfection p21 protein was reduced by 61% after 48 hours. The same siRNA expressed by a lentiviral vector showed a decrease of p21 protein by only 30% compared to untreated controls. Differences in p21 basis expression, or different integration sites of the lentiviral vector could be a reason for the observed variances in the effect of siRNA inhibition. The present study shows that a stable p21 inhibition by RNA interference can lead to an increased proliferation of dys- myoblasts. This could prevent the continuous loss of myoblasts and preserve cells for an additional gene and cell therapy. Following studies which focus on regulation of siRNA expression should assure redifferentiation of treated myoblasts. Although the loss of p21 alone seemed no cause of oncogenesis, retroviral vector systems have to be improved to minimize the risk of oncogenesis by random integration.
