Human cytosolic sulfotransferase 1A1 (SULT1A1), having the broadest specificity among sulfotransferase family, mediates the metabolism of myriads of small phenolic endobiotics and xenobiotics e.g. para nitrophenol. It catalyzes a sulfonate group transfer from a universal sulfonate donor: 3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulphate (PAPS) to an acceptor (Lig), leaving behind the non-sulfonated cofactor (PAP) and a sulfonated product (LigS). Having two binding sites randomly filled, SULT1A1 can be found in vivo in many complexes of different combinations of cofactor and ligand; apoform (SULT1A1), binary complexes (SULT1A1-PAP, SULT1A1-PAPS and SULT1A1-Lig) and ternary complexes (SULT1A1-PAP-Lig and SULT1A1-PAPS-Lig). SULT substrates are classified into three categories based on their binding affinities to various complexes: Neutral, positive and negative cooperativity substrates. Positive cooperativity substrates are ligands that have a high binding affinity for complexes containing the cofactor. Yet, the intermolecular enzyme-ligand interactions responsible for this positive cooperativity behavior are still unclear. In addition, there are no structural studies on complexes of different cofactor and ligand combinations and most of them are not crystallized. The aim of this work was to understand the interactions responsible for positive cooperativity behavior of SULT1A1 binders. To reach this goal, a combination of in silico tools was used. First, all crystallographic data of SULT1A1 were collected and compared to each other and to the structural data of other highly related enzyme members of overlapped specificity with SULT1A1. Second, 3D pharmacophores were employed to rationalize the positive cooperativity behavior of crystalized ligands. 3D models were generated from the structural data (structure-based) and from binder information collected from literature (ligand-based). Third, key complexes in the sulfonation cycle of SULT1A1, for which no structural information was available, were modeled and used for an MD study. The first step of the study, the structural investigation of all available SULT1A1 crystallographic data, was conducted to highlight the flexible regions. Structural analysis and calculated substrate binding site volumes of various SULT1A1 crystal structures hosting various binders confirmed the ligand-size dependent nature of the enzyme-substrate binding site, with the direct involvement of the gating loop (residues 85 – 90) conformation determining substrate binding site shape and volume. Structural investigation of SULT1A1 structure and other highly related siblings with overlapped substrate specificity and of the same family to identify the substrate binding site characteristics that are responsible for substrate specificity. Despite having binding site sequence and structural homology of high (SULT1A3) and low (SULT1E1) degree to SULT1A1, the MIF maps revealed completely different electronic environment of the substrate cleft which reflects the unique substrate specificity of each isoform. Data support that SULT1A1 pocket characteristics (ligand-induced size, ligand-induced geometry, and hydrophobic nature) defines its broad substrate specificity. The second step was the construction of a combination of structure-based, ligand-based, and docking- based 3D pharmacophores to explore the binding features of SULT1A1 ligands. Structure-based pharmacophores were derived from structural data of strong binders, whereas only substrates were available as co-crystallized ligands. Next, ligand-based pharmacophores were generated from experimentally determined SULT1A1 potent inhibitors. Lastly, one of the highly active substrates (3,3-diiodothyronine (T2)) and inhibitors (Ethinyl estradiol (EE)), with no available crystallographic data, were docked into the enzyme and subsequently docking-based 3D pharmacophores were developed for the most plausible poses. As retrospective validation, about 400 compounds (substrates, mixed substrates/inhibitors, inhibitors and decoys) have been screened through the pharmacophore filters to evaluate their ability to specifically retrieve the desired compounds. 107 SULT1A1 binders covering several activity classes and different chemical scaffolds (35 substrates, 26 mixed substrate/inhibitor, and 46 inhibitor) were successfully retrieved by virtual screening through the generated pharmacophores. The generated model showed good discriminative power to differentiate between inhibitors (that fit in one of inhibitors pharmacophores), substrates (that fit in one of substrates pharmacophores and not in inhibitors pharmacophores), and mixed substrates/inhibitors (that fit in one of inhibitors pharmacophores and in substrates pharmacophores) describing the essential features for enzyme binding (70% and 60% for substrates and inhibitors, respectively). However, no mechanistic explanation for positive cooperativity behavior could be found using these methods. Accordingly, it was necessary to mechanistically investigate binding behavior in a more detailed way. In order to consider the flexibility of the ligand- induced substrate binding site, molecular dynamics (MD) were employed in the third part of this study to get more insights about the dynamics of the missing complexes of the sulfonation cycle. Previously published studies on SULT used MD to sample the conformational space of an empty substrate binding site in cofactor-free and cofactor-containing complexes 21, 125, 171. Despite the importance of data provided by those studies, the induced volume and architecture of the substrate binding site can never be practically sampled without the existence of a ligand. Therefore, 100 ns molecular dynamic (MD) simulations were conducted for SULT complexes in the presence of neutral and positive cooperativity substrates. These simulations were useful to assess the stability of SULT1A1 complexes in different states of cofactor and ligand binding as well as bound to variety of different binders. MD combined with substrate binding site volume analysis suggests a relation between the size of the ligand, pocket dimensions and hence molecule substrate/inhibitor characteristics. Small hydrophobic binders (such as 2-naphthol (2NA)) were found to induce conformational reduction to the substrate binding site volume to reach 250 Å3. The positive cooperativity binding can be explained by the tight hydrophobic interactions with Phe81, Phe142, Phe76, Phe84, and Ile89 in cofactor-containing complexes. On the contrary, binding of small-sized substrates to apoenzyme destabilized the cofactor part of Loop 3 by distorting aromatic π-stacking between Tyr240 and Phe255. These findings rationalize the lower binding affinity of positive cooperativity substrates towards cofactor- free complex. When bigger positive cooperativity binders such as ethinyl estradiol (EE) are accommodated, Phe76 and Phe84 flexibility contribute to the opening of Pocket II and extend the hydrophobic system, allowing stacking interactions with the ligand and triplicating the pocket volume. This extra pocket opening partially “locks” large hydrophobic binders inside, even after sulfonation and might be responsible for their inhibitory effect. In summary, substrate binding site flexibility is responsible for the ligand-induced volume and shape alterations. Our work contributes to the general understanding of SULT1A1 broad specificity and low selectivity. Since all SULT members are structurally conserved to a great extent, insights obtained by studying SULT1A1 can be eventually extended to other family isoforms.
Die menschliche zytosolische Sulfotransferase 1A1 (SULT1A1) hat die breiteste Substratspezfität in der Familie der Sulfotranferasen und metabolisiert Myriaden von niedermolekularen phenolischen Endobiotika sowie Xenobiotika, z.B. p-Nitrophenol. Sie katalysiert den Transfer einer Sulfonat-Gruppe von einem universellen Sulfonat-Donor, dem 3'-Phosphoadenosine-5’-phosphosulphat (PAPS), auf einen Akzeptor (Lig) unter Bildung von nichtsulfoniertem Kofaktor (PAP) und dem sulfonierten Produkt (LigS). Aufgrund des Vorhandenseins von 2 Bindungsstellen, die besetzt oder nichtbesetzt sein können, kann SULT1A1 in vivo während der Reaktion in verschiedenen Kombinationen mit dem Kofaktor und dem Liganden vorliegen: Apoform (SULT1A1), binäre Komplexe (SULT1A1-PAP, SULT1A1-PAPS und SULT1A1-Lig) sowie ternäre Komplexe (SULT1A1-PAP-Lig und SULT1A1-PAPS-Lig). Substrate für SULT können in 3 Kategorien unterteilt werden, neutrale Substrate sowie solche mit positiver und negativer Kooperativität. Substrate mit positiver Kooperativität sind diejenigen, bei denen eine hohe Affinität zu kofaktorhaltigen Komplexen besteht. Allerdings sind die intermolekularen Enzym-Liganden-Interaktionen bislang nicht ausreichend charakterisiert. Zudem gibt es keine strukturellen Untersuchungen zu Komplexen mit unterschiedlichen Kombinationen von Kofaktoren und Liganden, die meisten liegen zudem nicht kristallisiert vor. Ziel der vorliegenden Arbeit war, Untersuchungen durchzuführen, die zu einem besseren Verständnis der positiven Kooperativität bei Liganden für SULT1A1 führen. Dazu wurden in silico-Methoden eingesetzt. Zunächst wurden verfügbare kristallographische Daten recherchiert und gesammelt, miteinander verglichen und dann mit Strukturdaten zu anderen, nah verwandten Enzymen mit SULT1A1-überlappender Substratspezifität verglichen. Im nächsten Schritt wurden 3D-Pharmakophore generiert, um in Bezug auf die positive Kooperativität von (kristallisierten) untersuchten Liganden relevante Charakteristika herauszuarbeiten. 3D-Modelle wurden generiert aus strukturellen Daten (Struktur-basiert; wwPDB) und aus Information zu Liganden aus der verfügbaren Literatur (Liganden-basiert). Im darauf¬folgenden Schritt wurden Schlüssel-Komplexe des Sulfonierungszyklus bei SULT1A1, für die bislang keine Strukturdaten existieren, modelliert und in einer MD(Molekulardynamik)-Studie modelliert. Im ersten Teil der Untersuchungen wurden Strukturuntersuchungen durchgeführt, in die alle verfügbaren kristallographischen Daten zu SULT1A1 miteinbezogen wurden, und die flexiblen Bereiche identifiziert. Durch die Strukturanalyse wurde bestätigt, dass die Enzym-Substrat-Bindungsstelle (bzw. -tasche) von der Größe des Liganden abhängig ist und dass über eine AS-Schleife im Zugangsbereich des Bindungsareals (AS 85-90) Form und Volumen des Substrats als Determinante miteingehen. Zudem wurde das Enzym verglichen mit anderen Isoformen aus der betreffenden Enzymfamilie, um Substrat-Bindungsstellen-Charakteristika zu identifizieren, die für die Substratspezifität relevant sind. Es wurde gefunden, dass die Substrat-Bindungsstelle am Enzym sehr hydrophob ist und aromatische und / oder -allgemein- hydrophobe Reste diese auskleiden, wobei hydrophile Reste hier kaum vorhanden sind. Die Ergebnisse aus den Strukturuntersuchungen bestätigen, dass Parameter der SULT1A1-Bindungsstelle (räumliche Parameter (Größe, Geometrie) und Lipophilie) die Substratspezifität bestimmen und das Profil des Bindungsverhaltens von Substraten an diesem Enzym erklären. Im zweiten Teil der Studien lag der Focus auf der Kombinierung von Struktur-basierten, Liganden-basierten und Docking-basierten Informationen, um 3D-Pharmakophore zu konstruieren, die der Erkundung des Bindungsverhaltens von SULT1A1-Liganden dienen sollten. Pharmakophor-Struktur-Charakteristika (für hochaffine, stark bindende Liganden; nur Substrat-Daten für kokristallisierte Liganden) für den Struktur-basierten Approach entstanden mithilfe von Informationen aus der wwPDB. Danach wurden Liganden-basierte Pharmakophore über experimentell festgestellte potente SULT1A1-Inhibitoren konstruiert. Zu guter Letzt wurden die Interaktionen eines sehr aktiven/affinen Substrates (3,3-Diiodthyronin) und eines Inhibitors (Ethinylestradiol (EE)), bei denen jeweils keine kristallographischen Daten vorlagen, mit dem Enzym untersucht und für die plausibelsten Konformationen Docking-basierte 3D-Pharmakophore entwickelt. Mit den verfügbaren Pharmakophor-Filtern wurden retrospektiv über 400 Substanzen gescreent (Substrat-, Substrat+Inhibitor-Mix-, Inhibitor- und Decoy-Moleküle), um die Selektivität des Modells zu testen bzw. zu bestätigen. Über 100 Substanzen aus dem Datenpool konnten durch 'virtual screening' über die entwickelten Pharmacophore identifiziert werden als SULT1A1-Liganden, wobei sie in Bezug auf ihre chemische Struktur unterschiedlich waren und auch unterschiedlichen Affinitäten zeigten (107 SULT1A1-Liganden; davon 35 Substrate, 26 gemischte Substrate+Inhibitoren, und 46 Inhibitoren). Mit dem entwickelten Modell liessen sich mit hoher Genauigkeit Liganden in Inhibitoren (in ein Inhibitor-Pharmacophor-Modell passend), Substrate (in ein Substrat- Pharmacophor-Modell und nicht in ein Inhibitor-Pharmacophor-Modell passend) sowie Substanzen mit sowohl Substrat- als auch Inhibitor-Eigenschaften (in ein Inhibitor- und ein Substrat-Pharmacophor-Modell passend) diskriminieren bzw. die für eine Enzymbindung essentiellen Merkmale beschreiben (70% für Substrate und 60% für Inhibitoren). Allerdings konnte keine mechanistische Erklärungsmöglichkeit für positive Kooperativität gefunden werden. Daher war es erforderlich, das Bindungsverhalten mechanistisch in anderer Weise zu untersuchen. Zur Untersuchung der Flexibilität der Liganden-induzierten Substratbindungsstelle wurden Molekulardynamik-Untersuchungen durchgeführt, die den dritten Part darstellen und Einsichten in die Dynamik der bislang nicht charakterisierten Komplexe des Sulfonierungszyklus gewähren sollten. Auch vorher publizierte Untersuchungen zu SULT implizierten den MD-Approach und hatten zum Inhalt, den konformativen Raum einer unbesetzten Substratbindungsstelle in Kofaktor-freien und Kofaktor-haltigen Komplexen "auszuleuchten". Allerdings wurde bei diesen Untersuchungen noch nicht berücksichtigt, dass das induzierte Volumen und die Architektur der Substratbindungsstelle nie in relevanter Weise in der Detailprofilierung erfasst werden kann, ohne dass ein Ligand präsent ist. Aus diesem Grund wurden für SULT-Komplexe 100ns-MD-Simulationen durchgeführt und dabei die Präsenz von solchen Substraten miteinbezogen, die sich entweder als neutral erwiesen hatten oder für die eine positive Kooperativität gefunden worden war. Diese Simulationen erwiesen sich als außerordentlich nützlich, um die Stabilität von SULT1A1-Komplexen in unterschiedlichen Phasen der Kofaktor- und Liganden- Bindung bei Bindung unterschiedlicher Substrate zu definieren. Die molekulardynamischen Studien und die Analyse des Volumens der Substratbindungsstelle weisen auf eine Beziehung zwischen der Größe des entsprechenden Liganden, den Dimensionen der Bindungstasche demzufolge den Substrat-/Inhibitor-Eigenschaften hin. Bei kleinen hydrophoben Liganden (wie beispielsweise 2-Naphthol (2NA) wurde in Bezug auf die Konformation an der Substratbindungsstelle gefunden, dass sie eine 50%ige Volumenreduktion (= auf 250 Å3 ) induzieren. Positive Kooperativität bei der Bindung kann erklärt werden durch enge hydrophobe Interaktionen mit Phe81, Phe142, Phe76, Phe84 und Ile89 in den Enzym-Substrat-Komplexen, die kofaktorhaltig sind. Im Gegensatz dazu destabilisierte die Bindung von kleinen bzw. niedermolekularen Substraten an das kofaktorfreie Apoenzym den Kofaktor-bindenden Teil in Schleife 3 durch Distorsion des aromatischen -Stackings bei Tyr240 und Phe255. Diese Ergebnisse geben eine Erklärung für die beschriebene geringere Bindungsaffitität von Substraten mit positiver Kooperativität im kofaktorfreien Enzym-Komplex. Interagieren größere Moleküle, die Substrate mit positiver Kooperativität darstellen (z.B. Ethinylestradiol (EE)), trägt die Flexibilität von Phe76 und Phe84 dazu bei, dass sich die Bindungstasche II öffnet und sich das hydrophobe System aufweitet, was wiederum dazu führt, dass der Ligand mit den Bindungsarealen interagieren kann und das Volumen der Bindungstasche sich verdreifacht. Diese zusätzliche Öffnung der Bindungstasche führt zu einem festen Einschluss größerer hydrophober Moleküle in der Tasche, auch noch nach der Sulfonierung, und kann die Ursache für einen inhibitorischen Effekt sein. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Flexibilität der Substratbindungsstelle Liganden-induzierte Veränderungen in Form und Volumen bedingt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der breiten Substratspezifität und geringen Selektivität bei SULT1A1. Und da alle Mitglieder der SULT- Enzymfamilie eine hohe Übereinstimmung in ihrer chemischen Struktur aufweisen, kann der hier für SULT1A1 gewählte Ansatz und können auch Hypothesen und Schlussfolgerungen ggf. auf andere Isoformen aus dieser Enzymafamilie übertragen werden.
