The ribosomal elongation cycle describes a series of reactions prolonging the nascent polypeptide chain by one amino acid and driven by two universal elongation factors termed EF-Tu and EF-G in bacteria. EF-Tu brings aminoacyl- tRNA (aa-tRNA) to the ribosome in an aa-tRNA EF-Tu GTP ternary complex form, delivers the cognate aa-tRNA at the decoding center of the ribosomal A-site and after EF-Tu dependent GTP cleavage - leaves the ribosome in the EF- Tu GDP form. After aatRNA has been accommodated completely at the A site (the aminoacyl residue is now present at the peptidyltransferase center), the dipeptide bond will be catalyzed to form, namely the peptide will be transferred to the aminoacyl-tRNA so that the peptide is prolonged by one amino acid residue. After that, EF-G GTP enters, triggers the translocation of the two tRNAs from A- and P-site to the P- and E- sites respectively, the GTP is hydrolyzed and EF-G GDP leaves ribosome. Now the A-site is free and a new cycle starts. In this work an extremely conserved protein LepA, a protein belonging to the Gclass and presenting in all bacteria and mitochondria, is identified and characterized as a third elongation factor required for accurate and efficient protein synthesis. LepA is essential for cell viability at high ionic strength, where without LepA - translocation is occasionally impaired thus provoking translational misreading or probably even a translational halt. LepA GTP recognizes this unfavorable situation of the ribosome and restores the translational fidelity, in that it back-translocates the stuck ribosome thus giving EF-G a second chance to translocate the tRNAs correctly. However, LepA does not counteract decoding errors induced by antibiotics such as aminoglycosides and edeine. The novel function of LepA as a back-translocator also has implications for the fundamental process of translocation. LepA has an important application potential, since only after addition a small amount of LepA (less than 0.3 molecules per ribosome) to coupled transcriptiontranslation systems 100% active proteins can be synthesized in vitro. This application has been patented.
Der ribosomale Elongationszyklus beschreibt eine Reihe von Reaktionen, welche die werdende Polypeptidkette, angetrieben durch zwei Proteinfaktoren EF-Tu und EF-G, um eine Aminosäure verlängern (in Archaea und Eukarya heißen die entsperechene3n Faktoren EF1 und EF3). EF-Tu bringt Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) als ternären Komplex in der Form aa-tRNA EF-Tu GTP zum Dekodierungszentrum der ribosomalen A-Stelle. Die kognate aa-tRNA verbleibt dort, während nach EF-Tu abhängiger GTP Hydrolyse EF-Tu GDP das Ribosom verläßt. Nachdem die kognate aa-tRNA vollständig in die A-Stelle akkommodiert, wird die Dipeptidbindung vom Peptidyltransferase Zentrum katalysiert. Dabei wird das Peptid auf die aa-tRNA übertragen, so dass das Peptid um einen Aminosäurerest verlängert wird. Schließlich dockt EF-G in seiner GTP-Form an das Ribosomen, katalysiert die Translokation der beiden tRNAs von der A- zur P-Stelle bzw. von der P- zur E-Stelle. Danach hydrolysiert EF-G das GTP und EF-G GDP verlässt das Ribosom. Die A-Stelle ist nun frei und ein neuer Zyklus kann beginnen. In dieser Arbeit wird das extrem konservierte Protein LepA, das in allen Bakterien und Mitochondrien vorhanden ist und zur klasse der G-Proteine gehört, als dritter Verlängerungsfaktor identifiziert und charakterisiert. LepA ist für eine fehlerfreie und effiziente Proteinsynthese erforderlich und für die Lebensfähigkeit von Zellen unter hohen Ionenstärken wesentlich. Ohne LepA ist die bakterielle Translokation gelegentlich unvollständig, was zu Aminosäuren- Fehleinbau und wahrscheinlich auch zur Blockierung des Ribosoms führen kann. LepA GTP erkennt diese Situation und löst eine Rück-Translokation aus, so dass EF-G eine zweite Chance für eine korrekte Translokation erhält. LepA korrigiert nicht Dekodierungsfehler, die durch Antibiotika wie Aminoglykoside und Edein verursacht werden. Vielmehr verhindert es Fehleinbau als Folge von Translokationsdefekten. Die neuartige Funktion von LepA als Rück-Translokator lässt somit auch neue Schlüsse für den Translokationsprozess selbst zu. LepA hat ein bedeutendes Anwendungspotential für in vitro Proteinsynthese. Nur nach Zugabe kleiner Mengen von LepA (unter 0.3 Moleküle per Ribosom) ist es möglich, im gekoppelten Transkriptions-Translations-System 100% aktive Proteine zu synthetetisieren. Dieser LepA Effekt wurde von uns patentiert.
