Zusammenfassung Material und Methoden Ziel dieser Untersuchung war es, mit Hilfe der Morphometrie bzw. mit histochemischen und immunhistochemischen sowie rasterelektronenmikroskopischen Methoden den Einfluss des Probiotikums Bacillus cereus var. toyoi (ToyoCerin®) auf die Darmschleimhaut von je fünf 14, 28, 35 und 56 Tage alten Ferkeln zu untersuchen. Je Altersgruppe dienten 5 Tiere als Kontrollen. Den Muttertieren wurde ab dem 25. Trächtigkeitstag und den Ferkeln ab dem 15. Lebenstag das Probiotikum über das Futter verabreicht. Unmittelbar nach der Tötung der Ferkel mittels Eutha 77 sind Gewebeproben aus dem Duodenum (4), proximalen (5) und distalen (6) Jejunum, Ileum (7), Caecum (8) sowie Colon ascendens (9) und Colon descendens (10) entnommen worden. Proben für die Lichtmikroskopie wurden in Bouin’scher Lösung und für die Rasterelektronenmikroskopie in 2 % Paraformaldehyd + 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1M Cacodylatpuffer (pH 7,4) fixiert. Die morphometrischen Untersuchungen erfolgten mit Hilfe des computergestützten Bildanalyseprogramms „Lucia 32-G Corona 4.11“ (Zeiss, Germany). Morphologische Untersuchungen wurden mittels des rasterelektronenmikroskopes „Zeiss Nanolab 2000“ durchgeführt. Es wurden Zottenlänge und –breite, die Kryptentiefe und –breite, sowie der Vergrößerungsfaktor der Schleimhautoberflächen an ca. 5 Jm dicken HE-Schnitten bei 62,5– bzw. 125-facher Vergrößerung gemessen. Eine quantitative Bestimmung der Becherzellzahl erfolgte mittels der Alcianblau (2,5)-PASFärbung. Zum Nachweis proliferierender Zellen pro Kryptenumfang wurde der gegen das Kernprotein Ki67 gerichtete MIB-1-Antikörper angewandt. Des Weiteren erfolgte an diesen Schnitten die Auszählung der Gesamtzellzahlen pro Kryptenumfang. Ergebnisse Anhand der rasterelektronenmikroskopischen Untersuchungen ist deutlich zu erkennen, dass die Struktur der Dünndarmschleimhaut je nach Darmabschnitt, unabhängig vom Alter oder von der Fütterungsgruppe, stark variieren. So finden sich sowohl in der Kontrollgruppe und in den B. cereus gefütterten Tieren zungen–, finger–, und blattförmige Zotten sowie sogenannte Zottenkämme. Die Ileumschleimhaut zeichnet sich zusätzlich durch (über den Peyer-Plaques liegende) Dome aus, die von blattförmigen Zotten überragt werden. Bei der Auswertung der Zottenformen mittels eines Punktesystems konnte deren hohe Variabilität weiter untermauert werden. Die statistische Auswertung ergab sehr große Standardabweichungen. Bei den morphometrischen Befunden ergaben sich zwischen den Kontrolltieren und den mit Probiotikum gefütterten Tieren nur in einzelnen Fällen signifikante Unterschiede. Signifikante Gruppenunterschiede (p≤0,05) traten bei der Messung der Kryptenbreiten im Colon ascendens der 14 Tage alten Kontrolltiere sowie bei der Ermittlung des Vergrößerungsfaktors der Zotten im Duodenum der 28 und 56 Tage alten Tiere auf. Die Werte waren signifikant höher als bei den Probiotikumtieren. Im Ileum der 35 Tage alten Tiere war die Gesamtzahl der Zellen pro Kryptenumfang bei Probiotikumtieren signifikant größer als bei Kontrolltieren. Die Auswertung der Zottenlängen ergab im Duodenum deutliche Unterschiede bei den 28 und 56 Tage alten Kontrolltieren im Vergleich zu den 35 Tage alten Tieren. Es zeigte sich eine tendenzielle Verkürzung der Zottenlängen am 35. Tag. Dieses Ergebnis korreliert mit den Messungen des Vergrößerungsfaktors der Schleimhautoberfläche durch Zottenbildung. Die bei diesem Faktor ermittelten geringeren Standardabweichungen weisen auf eine geringere individuelle Variabilität, im Vergleich zu Einzelmessungen der Zottenlängen und Kryptentiefen, hin. Bei der Ermittlung der Zottendimensionen erkennt man in beiden Fütterungsgruppen mit zunehmendem Alter eine tendenzielle Zunahme von deren Breite. Diese Erscheinung trifft auch für die Tiefe der Krypten zu. Hierbei ist festzustellen, dass die Krypten der Dickdarmschleimhaut tiefer sind als die des Dünndarms. Bei der Bestimmung des Vergrößerungsfaktors für die Darmoberfläche durch Kryptenbildung zeigen sich signifikante Alters– und Darmabschnittseffekte, welche mit den Messungen der Kryptentiefen korrelieren. Eine altersabhängige Zunahme dieses Faktors ist besonders im Duodenum zu beobachten. Die Zotten des Duodenums und Ileums weisen bei – im Vergleich zu den Jejunalzotten – geringerer Länge wesentlich mehr Becherzellen auf. Allerdings sind die Zotten im Duodenum und Ileum insgesamt breiter als im Jejunum, so dass sich die vermehrte Anzahl von Becherzellen erklären lässt. Die Anzahl an Becherzellen im Kryptenbereich ist im Dickdarm deutlich höher als im Dünndarm. Eine altersabhängige Zunahme der Becherzellen ist jedoch nicht zu erkennen. Die Anzahl der proliferationsaktiven Zellen ist, verglichen mit den restlichen Darmabschnitten, in den Krypten des distalen Jejunums in beiden Fütterungsgruppen am größten. Setzt man die Anzahl der proliferierenden Zellen in Bezug zu 100 Kryptenzellen, so zeigen sich Alters– und Darmabschnittseffekte. Tendenziell weisen die älteren Tiere insgesamt mehr mitoseaktive Zellen auf. Im Colon ascendens sind signifikante Unterschiede zwischen den 14 und 35 auf der einen sowie den 56 Tage alten Tieren auf der anderen Seite aufgetreten. Mit Ausnahme der gesamten Zellzahl pro Kryptenumfang im Ileum der 35 Tage alten Tiere zeigen sich signifikante Gruppenunterschiede bei der Auswertung der Kryptenbreite und des Vergrößerungsfaktors durch Zottenbildung, allerdings zugunsten der Kontrolltiere. Aufgrund dieser Ergebnisse komme ich zu dem Schluss, dass die Verwendung des Probiotikums Bacillus cereus var. toyoi als Zusatz zum Ferkelfutter – abgesehen von Einzelfällen – keinen entscheidenden positiven oder negativen Einfluss auf die Morphologie des Dünn– und Dickdarms bewirkt hat.
Summary Effects of the probiotic Bacillus cereus var. toyoi on the structure of the intestinal mucosa in pigs. Material and Methods The aim of the study was to examine the influence of the probiotic Bacillus cereus var. toyoi (ToyoCerin®) on the mucous membrane of 5 piglets aged 14, 28, 35 and 56 days, respectively, employing morphometry as well as histochemistry, immuno- histochemistry and scanning electron microscopy. For each age group, 5 control animals were additionally examined. Both, sows - from the 25th day of pregnancy - and the piglets - from the 15th day post partum-, were supplied with probiotic-supplemented feed rations. Tissue samples were taken directly after euthanasia (using Eutha 77®) from the following locations: duodenum (4), proximal (5) and distal (6) jejunum, ileum (7), caecum (8) as well as ascending colon (9) and descending colon (10). Samples destined for light microscopy were fixed in Bouin solution, and for scanning electron microscopy in 2% paraformaldehyde + 2.5% glutaraldehyde solved in 0.1M cadodylate buffer (pH 7,4). Morphometry was carried out with the computer-aided analysis software Lucia 32-G Corona, version 4.11 (Zeiss, Germany). The morphological examination was carried out using the scanning electron microscope Nanolab 2000 (Zeiss, Germany). The following parameter were measured on HE-stained histological sections with a thickness of approx. 5 =m employing either magnification x 62,5 or x 125: villi length and width, crypt length and width, surface enlargement factor of the mucous membrane. A quantitative evaluation of the number of goblet cells was carried out employing alcian blue (2.5)-PAS staining. The proliferating cells per crypt circumference were detected using the MIB-1 antibody that reacts with the nuclear protein Ki67. Additionally, the thus treated sections were used to enumerate the total cell count per crypt circumference. Results The scanning electron microscopic examination revealed that the shape of the respective section of the small intestine varied distinctly, with no direct relation to either age or feeding group. Thus, both control and B. cereus-fed animals featured tonguelike, fingerlike and foliate villi as well as crest like villi. The ileal mucous membrane is also characterized by specific dome formations above the Peyer plaques overlapped by foliate villi. Employing a system for evaluating the shape of the villi relying on a point-based grading system, the high variability of villi shape was verified. The statistical analysis revealed a very high standard deviation. The morphometry results revealed significant differences between control animals and probiotic-fed animals in single cases only. Significant differences between groups (p≤ 0.05) were detected concerning the measurements of crypt width within the ascending colon of control animals as well as concerning the enlargement factor of the duodenal villi in 28 and 56 days old animals. These values were significantly higher than in probiotic-fed animals. Within the ileum of 35 days old animals, the total cell count per crypt circumference of the probiotic-fed animals was significantly higher than in the respective control animals. The evaluation of the duodenal villi length revealed distinct differences between the 28 and 56 days old control animals in comparison to the 35 days old animals. A tendency towards decrease of villi length was detected on day 35. The result correlates with the measurements of the enlargement factor of the mucous membrane via villi formation. The slight standard deviation established for this factor points to a slight individual variability with regard to the individual measurements of villi length and crypt depth. The evaluation of villi dimensions detected a tendency of age- depending increasing villi width in both feeding groups. This also applies to the crypt depth, while it has to be stated that the crypts within the mucous membrane of the large intestine were generally deeper than those of the small intestine. The evaluation of the enlargement factor of the intestinal surface via formation of crypts revealed significant age- and region-related differences that correlated with the measurements of the crypt depth. An age- related increase of this factor was particularly distinct within the duodenum. The villi of the duodenum and the ileum feature distinctly more goblet cells while - compared to those of the jejunum - they display lesser length values. On the other hand, the duodenal and ileal villi are generally wider than those of the ileum, thus explaining their increased number of goblet cells. The number of goblet cells within the large intestine is distinctly higher than in the small intestine, with no detectable age-related increase of goblet cells. When comparing all intestinal regions, the number of proliferating cells is highest within the crypts of the distal jejunum for both feeding groups. Relating the number of proliferating cells to a cell count of 100 crypt cells, age- and regionspecific effects are detectable. Older animals tend to display generally more mitosis-reactive cells. Within the ascending colon, significant differences between the 14 and the 35 days old animals were revealed. With the exception of the total cell count per crypt circumference within the ileum of 35 days old animals, significant group differences occurred within the evaluation of crypt width and enlargement factor via villi formation, however in favour of the control animals. Based on the present results it can be concluded that the application of the probiotic Bacillus cereus var. toyoi as supplement to the piglet diet - except in individual cases - did not achieve any essential positive or negative effect on the morphology of the small and the large intestine.
