Die permanente Entstehung von Driftvarianten des Influenzavirus reduziert die Effektivität der derzeit angewandten Stamm-spezifischen Grippeschutzimpfung und erschwert eine zeit- und kosteneffizienten Produktion. Zusätzlich bergen zoonotische Influenza-Subtypen starkes pandemisches Risiko, was die Entwicklung eines breitenwirksamen Impfstoffes forciert. Als Teil des von der EU geförderten UNISEC-Projekts wurde innerhalb der vorliegenden Arbeit ein vektorielles Impfstoffsystem untersucht, welches durch Immunisierung gegen das hoch-konservierte Influenza Nukleoprotein (NP) mittels Adenovirus-assoziierten Virus Serotyp 9 (AAV9) eine langanhaltende kreuzreaktive T-Zell-Antwort induziert. Es konnte mittels in vivo Imaging im Mausmodell eine stabile AAV9-basierte Transgenexpression sowohl nach intramuskulärer als auch nach intranasaler Applikation über einen Zeitraum von 12 Monaten verfolgt werden. Die Stärke der Transgen-spezifischen humoralen Immunantwort im Serum und der Nachweis einer T-Zell-Reaktion 12 Monate nach Immunisierung wies die Induzierbarkeit einer langanhaltenden Immunität nach. AAV-basierte Immunisierung mit dem NP des pandemischen Virus Influenza A H1N1pdm09 und dem NP der Maus-adaptierten Variante Influenza A H1N1 PR8 führte zu starken T Zell Antworten im Mausmodell und schützte die Tiere nach homologer Belastung. Obwohl Ergebnisse früherer Studien auf eine Kreuzreaktivität NP-spezifischer T-Zellen hinweisen, konnte eine Immunisierung mit dem NP von H1N1pdm09 nicht gegen eine heterologe Belastung mit PR8 schützen. Das immunodominante CD8+ T -Zell-Epitop (NP366-374) wurde folglich durch Punktmutation an PR8 angepasst. Dieses modifizierte Konstrukt vermittelte eine bislang noch nicht im Belastungsversuch quantifizierte Impfeffektivität von 60 %. Basierend auf diesen Ergebnissen war ein subtyp-übergreifender Schutz nach AAV basierter Immunisierung mit einer synthetischen Kette aller immunrelevanten CD8+ T Zell Epitope der verwendeten Mauslinie wahrscheinlich. Immunisierung mit diesem Vektor schützte die Tiere im Belastungsversuch mit PR8 jedoch nicht. Dies könnte auf eine fehlende Induktion weiterer Komponenten des Immunsystems als den NP Epitop spezifischen CD8+ T-Zellen zurückgeführt werden. Erstmalig konnte im Zuge der vorliegenden Arbeit ein System etabliert werden, das es erlaubt die zytotoxische Aktivität spezifischer CD8+ T-Zellen im lebenden Tier mittels in vivo Imaging zu verfolgen. Anhand des Assays konnte nachgewiesen werden, dass nach AAV-basierter Immunisierung mit dem Volllängen-NP spezifische T-Zellen unmittelbar Target-Zellen im Tier eliminieren konnten. Dieser in vivo-Effekt konnte nach Immunisierung mit der Epitopkette jedoch nicht nachgewiesen werden. Während im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schwachstellen eines NP-basierten monovalenten Impfstoffes aufzeigt werden konnten, konnte gleichzeitig geschlussfolgert werden, dass eine starke NP- spezifische Immunreaktion innerhalb einer multivalenten Immunisierung eine wichtige Rolle zugeschrieben werden kann. AAV eignet sich aufgrund vorteilhafter Charakteristika bezüglich Produktionseffizienz, Lagerung, Sicherheit im Menschen sowie Dauer und Stärke der Transgen-spezifischen Immunantwort ausgezeichnet für die Entwicklung einer Vektor-basierten, breitenwirksamen Influenza-Vakzine.
The permanently evolving drift variants of influenza virus often reduce the effectiveness of commonly used strain specific flu vaccines and make it difficult to produce vaccines in a time and cost effective manner. This, and the near certainty of a zoonotic influenza infection leading to a new pandemic in the future, drives efforts to develop broadly-protective vaccines. As part of the EU-funded UNISEC project, this work investigated a vectored vaccine system based on immunization against the highly conserved influenza nucleoprotein (NP). The aim was to use adenovirus-associated virus serotype 9-mediated NP gene transfer to induce a long-lasting, cross-reactive T cell response. Stable AAV9-mediated transgene expression over a period of 12 months following intramuscular or intranasal administration in mice was demonstrated by in vivo imaging. The levels of transgene-specific antibodies and T-cells maintained during this time confirmed the induction of a sustained immune response. Immunization of mice with AAVs expressing the NP of the pandemic influenza A strain H1N1pdm09 and of the mouse-adapted laboratory strain A H1N1 PR8 resulted in strong T cell responses and after challenge with the homologous influenza, all mice were protected. Although previous data had indicated that NP-specific T cells were cross-reactive, immunization with the NP of H1N1pdm09 was not able to protect against heterologous challenge with PR8. The AAV-NP of H1N1pdm09 was therefore modified by point mutation to match the immunodominant epitope (NP366-374) of PR8. This showed, for the first time, that the epitope is protective for at least 60 % of the animals tested. Based on these results, it seemed likely that AAV-mediated immunization using a synthetic chain of all known NP CD8+ T cell epitopes for the mouse strain would be broadly protective. However, mice immunized with such a vaccine succumbed rapidly to challenge with PR8. This may be explained by the lack of immune responses other than selected NP epitope-specific CD8+ T cells. The work presented here included, for the first time, the establishment of a system to track the cytotoxic activity of specific CD8+ T cells in living animals using in vivo imaging. Using this assay it was possible to demonstrate that, whereas T-cells induced by AAVs expressing the complete NP were able to rapidly clear target cells from the body, no such in vivo effect was observed after immunization with the NP epitope chain. This work demonstrates that although NP-based monovalent vaccines have weaknesses that need to be overcome, it nevertheless confirms that a strong NP-specific immune response could play a critical role as part of a multivalent vaccine. The advantages of AAV with regard to manufacturing efficiency, storage, safety in humans as well as the duration and strength of transgene-specific immune response, make it an excellent candidate for the further development of vectored broadly reactive influenza vaccines.
