Der elektrogene Natriumtransport wird im distalen Colon durch den Epithelialen Natrium-Kanal (ENaC) kontrolliert. Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) ist die Induktion des ENaC reduziert, wofür hauptsächlich die Hemmung der Transkription des ENaC durch pro- inflammatorische Zytokine wie TNF-α verantwortlich ist. Dies kann therapeutisch durch den Einsatz von Glucocorticoiden (GC) überwunden werden, die neben einer allgemeinen anti-inflammatorischen Wirkung auch einen schnellen Anstieg der Na+-Resorption zur Folge haben. Während für die ENaC- Induktion durch Mineralocorticoide eine Antagonisierung durch TNF-α nachgewiesen werden konnte, wurde das Zusammenspiel von GC und TNF-α im Hinblick auf die ENaC-Regulation bisher noch nicht untersucht. Daher wurde im ersten Projektteil dieser Arbeit der Einfluss von TNF-α auf die ENaC-Induktion durch das synthetische Glucocorticoid Dexamethason im distalen Rattencolon und in der humanen Colon-Zelllinie HT-29/B6-GR charakterisiert. In beiden Systemen konnte nachgewiesen werden, dass Dexamethason nicht nur der TNF-α-vermittelten Inhibition des ENaC entgegenwirkte, sondern sogar eine synergistische Induktion des ENaC-abhängigen Na+-Transports verursachte. Dieser Synergismus resultierte aus einer durch TNF-α vermittelten Stabilisierung der mRNA des Glucocorticoidrezeptors (GR) und einer daraus folgenden Steigerung des GR- Proteinniveaus im Zusammenspiel mit der Aktivierung des GR durch Dexamethason. Parallel dazu wurde die Transkription der β- und γ-Untereinheit des ENaC gesteigert, wodurch es zu einer erhöhten ENaC-vermittelten Na+-Resorption kam. Weiterhin konnte demonstriert werden, dass für den beobachteten Synergismus die MAP-Kinase p38 eine entscheidende Rolle spielt. Die Beobachtung eines synergistischen Effekts von TNF-α und Dexamethason bei der Induktion des ENaC- vermittelten Na+-Transports liefert eine Erklärung für die schnelle und ausgeprägte Resorptionssteigerung und anti-diarrhoische Wirkung von Glucocorticoiden bei der Behandlung von CED. Neben Glucocorticoiden wird bei CED die kurzkettige Fettsäure Butyrat therapeutisch eingesetzt. Es wurde beobachtet, dass Butyrat ebenfalls eine transkriptionelle Expressionssteigerung des ENaC bewirkt. Für die Generierung signifikanter Na+-Transportraten via ENaC war die zusätzliche Anwesenheit von Corticosteroiden essentiell, jedoch blieben die zugrunde liegenden Mechanismen aufgrund des Mangels eines Mineralocorticoidrezeptor (MR)-exprimierenden Colonzellmodells bislang ungeklärt. Im zweiten Projektteil dieser Arbeit wurde daher ein epitheliales Colonzellmodell generiert, das induzierbar den MR exprimiert (HT-29/B6-Tet-On-MR). In diesem Zellmodell ließen sich durch nanomolare Dosen des Mineralocorticoids Aldosteron funktionell aktive ENaC- Kanäle induzieren. Voraussetzung dafür war jedoch die gleichzeitige Präsenz von Butyrat, das eine verstärkte Expression des MR nach sich zog. Dies gewährleistete eine Aldosteron-abhängige Stimulation der Expression von β- und γ-ENaC. Da Butyrat allein keinen signifikanten ENaC-vermittelten Na+-Transport auslöste, wurde bei der Suche nach weiteren Aldosteron-abhängigen Genen das Protein GILZ (Glucocorticoid-induced Leucin Zipper) als möglicher Faktor bei der Steigerung des ENaC-Niveaus in der apikalen Zellmembran identifiziert.
The epithelial sodium channel (ENaC) mediates electrogenic sodium absorption in the distal large intestine. In patients with inflammatory bowel disease (IBD), ENaC induction is impaired, mainly via transcriptional suppression by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor (TNF)-α. This can be overcome by glucocorticoid therapy which promotes an anti-inflammatory effect as well as a rapid increase in sodium absorption. While ENaC induction by mineralocorticoids has been shown to be antagonized by TNF-α, the interplay between glucocorticoids and TNF-α in ENaC regulation has remained elusive. Therefore, in the first part of this project, the influence of TNF-α on ENaC induction by the synthetic glucocorticoid dexamethasone has been characterized in rat distal colon and in the human colonic cell line HT-29/B6-GR. In both systems, dexamethasone not only preserved TNF-α-mediated ENaC suppression but caused synergistic induction of ENaC-dependent sodium absorption. This synergism was the result of a TNF-α-mediated stabilization of glucocorticoid receptor (GR)-mRNA leading to enhanced GR protein levels and a subsequent GR transactivation by dexamethasone. In parallel, transcription of the ENaC β and γ-subunits was up-regulated which increased ENaC-dependent sodium absorption. Furthermore, it was revealed that the activitiy of mitogen-activated protein kinase p38 was required for the observed synergy. The synergistic increase in ENaC-mediated sodium transport via an enhanced expression of ENaC subunits β and γ dependent on TNF-α and dexamethasone explains the rapid and intense proabsorptive effect of glucocorticoid therapy in IBD. Besides glucocorticoids the short-chain fatty acid butyrate is applied in the therapy of IBD. It was shown that butyrate also induces transcriptional up-regulation of ENaC. Still, for the generation of significant transport rates via ENaC the additional presence of corticosteroids was essential. The underlying mechanisms of this observation remained unknown due to the lack of a colonic cell line expressing functional mineralocorticoid receptor (MR). In the second part of this project, an epithelial colonic cell model inducibly expressing the MR (HT-29/B6-Tet-On-MR) was generated. In this cell model, nanomolar doses of the mineralocorticoid aldosterone induced functional ENaC. The simultaneous presence of butyrate was a prerequisite for this induction, leading to high- level expression of the MR. This allowed for aldosterone-dependent up- regulation of β and γ-ENaC expression. As butyrate alone was not capable of promoting ENaC-mediated sodium transport, aldosterone-induced GILZ (Glucocorticoid-induced Leucin Zipper) was identified as a candidate factor increasing ENaC levels.
