Coordinating growth arrest and myogenesis in muscle stem cells: A molecular and cellular analysis

Abstract

Tightly controlled growth arrest coordinates the equilibrium between cell proliferation and cell differentiation during embryonic tissue formation as well as in adulthood during stem cell-mediated tissue regeneration. Myogenic differentiation requires a coordinated course of tissue-specific gene expression and irreversible cell cycle exit. However, I contributed to showing -using genetic manipulation in the mouse embryo- that these processes can be uncoupled. During development, growth arrest in myogenic cells is mediated by the cyclin-dependent kinase inhibitors (CDKIs) p21 and p57, which act redundantly to promote cell cycle exit. We demonstrated that skeletal muscle progenitors require a direct interaction with the differentiating myoblasts via the Notch signaling pathway to maintain their pool. We also identified a muscle-specific regulatory element of p57 that directly receives the input of Myogenic Regulatory Factors (MRFs) and Notch downstream targets. During my Ph.D. I examined whether this regulatory mechanism is also involved in postnatal myogenesis. Adult skeletal muscle has a remarkable regenerative capacity, involving a stem cell population, called satellite cells (SCs), located on close contact to the myofibers under the basal lamina. At the transition from juvenile to adult state (around 3-4 week during postnatal growth in mice) they enter a non-cycling, quiescent state. Upon injury the SCs rapidly get activated, expand by proliferation and provide differentiated progeny for muscle repair, while a subpopulation self-renews and re-enters quiescence, allowing the support of additional rounds of muscle damage. To understand the mechanisms regulating acquisition of quiescence, we explored the role of the aforementioned CDKIs in adult muscle. Although absent from quiescent SCs, they become rapidly expressed upon activation (even in proliferating myoblasts) and their levels remain high in the differentiating muscle cells. Strikingly, during the course of differentiation p57 translocated from the cytoplasm of activated myoblasts to the nuclei of differentiating cells. Since p57 deficient mice die at birth, we generated a conditional knock-out allele to perform functional studies at the postnatal stages. This new allele, in which the coding region can be removed by the loxP/Cre recombination system, also contains a β- galactosidase reporter allowing the identification of p57-expressing cells. We generated a complete loss of function allele using a ubiquitously expressed Cre, and observed developmental and perinatal phenotypes similar to previously described germline knock-outs. Furthermore, we showed that the reporter inserted in the p57 conditional allele faithfully recapitulates p57 expression profile at embryonic and adult tissues. Conditional ablation of p57 in adult SCs resulted in reduced myogenic differentiation in primary myoblast culture. Similarly, p21-null myoblasts exhibited proliferation and differentiation defects in single myofiber cultures. In vivo regeneration studies with p21 mutants showed an early impact on the SC pool, while both SCs and muscle structure were re- established by the end of the regeneration process. My Ph.D. work suggests that p21 and p57 are at play during adult myogenesis and cell cycle exit, although via different mechanisms compared to the developmental scenario. They both work at the early steps of satellite cell activation but do not compensate for each other’s loss. Future studies will elucidate whether they lie genetically downstream of the MRFs and Notch targets during postnatal myogenesis.

Das Gleichgewicht zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung wird während der embryonalen Gewebebildung sowie während der stammzellvermittelten Geweberegeneration im Adultstadium durch einen streng kontrollierten Wachstumsarrest koordiniert. Die myogene Differenzierung erfordert sowohl eine koordinierte Abfolge von gewebespezifischer Genexpression als auch einen irreversiblen Zellzyklusaustritt. Jedoch konnte ich durch genetische Manipulation von Mausembryos dazu beitragen, aufzuzeigen, dass diese beiden Prozesse voneinander entkoppelt werden können. Ein Wachstumsarrest myogener Zellen wird während der Entwicklung durch die Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitoren (CDKIs) p21 und p57 vermittelt. Letztere wirken dabei redundant, um einen Zellzyklusaustritt zu fördern. Wir konnten bereits nachweisen, dass skelettale Muskelvorläuferzellen eine direkte Interaktion mit differenzierenden Myoblasten über den Notch-Signalweg benötigen, um ihren Pool aufrecht zu erhalten. Des Weiteren haben wir ein muskelspezifisches regulatorisches Element von p57 identifiziert, das direkten Input von myogenen Regulationsfaktoren (MRFs) und Notch Stromabwärts-Zielen erhält. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich untersucht, ob dieser regulatorische Mechanismus auch in der postnatalen Myogenese involviert ist. Der adulte skelettale Muskel hat eine bemerkenswerte regenerative Kapazität, die eine Stammzellpopulation, sogennante Satellitenzellen (SCs, engl. für "satellite cells") involviert. Diese befinden sich zwischen der Basallamina und der Muskelfaser. Beim Übergang zwischen juvenilen und adultem Stadium (zwischen 3-4 Wochen während des postnatalen Wachstums in Mäusen), gehen die Satellitenzellen in einen nicht-zyklischen Ruhezustand über. Satellitenzellen werden nach einer Verletzung schnell aktiviert, expandieren und stellen differenzierte Abkömmlinge für die Muskelreparatur zur Verfügung. Eine Subpopulation der Satellitenzellen erneuern sich selbst und gehen zurück in den Ruhezustand, so dass bei erneuter Muskelverletzung Unterstützung gewährleistet ist. Um die Mechanismen verstehen zu können, die den Übergang in den Ruhezustand regulieren, haben wir die Rolle der zuvor genannten CDKIs im adulten Muskel untersucht. Obwohl CDKIs in ruhenden Satellitenzellen abwesend sind, werden sie nach Aktivierung der Satellitenzellen schnell exprimiert, und ihr Expressionslevel bleibt in differenzierenden Muskelzellen aufrecht erhalten. Erstaunlicherweise transloziert p57 während des Differenzierungsprozesses vom Zytosplasma in den Zellkern. Da p57-defiziente Mäuse bei Geburt sterben, haben wir eine konditionelle Mausmutante generiert, um funktionale Studien im postnatalen Stadium durchführen zu können. Dieses neue Mausmodell hat ein modifiziertes p57-Allel, in dem die codierende Region von p57 durch loxP/Cre-Rekombination entfernt werden kann. Des Weiteren beinhaltet es auch das Reportgen β-Galactosidase, um p57-exprimierende Zellen identifizieren zu können. Wir haben durch eine ubiquitär exprimierte Cre- Rekombinase vollständige Knockout-Mäuse generiert und dabei entwicklungsorientierte und perinatale Phänotypen, ähnlich wie bei bereits beschriebenen Knockout- Mäusen, beobachtet. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass der in das konditionelle p57-Allel eingefügte Reporter dem Expressionsprofil von p57 im embryonalen und adulten Gewebe entspricht. Konditionelle Ablation von p57 in Satellitenzellen resultierte in einer reduzierten myogenen Differenzierung von primären Myoblastenkulturen. p21 -defiziente-Myoblasten wiesen ähnliche Proliferation- und Differenzierungsdefekte in einzelnen Muskelfaser-Kulturen auf. In-vivo- Regenerationsstudien mit p21-Mutanten haben eine initiale Reduktion der Satellitenzellenanzahl gezeigt. Zum Ende des Regenerationsprozesses waren die Anzahl der Satellitenzellen sowie die Muskelstruktur jedoch re-etabliert. Meine Doktorarbeit lässt darauf schließen, dass p21 und p57 während der adulten Myogenese und des Zellzyklusaustritts eine Rolle spielen, jedoch unterscheidet sich der Mechanismus im Vergleich zum pränatalem Stadium. Beide fungieren bei frühzeitigen Schritten der Satellitenzellenaktivierung, aber kompensieren sich nicht für den gegenseitigen Verlust. Künftige Studien werden zeigen, ob p21 und p57 von MRFs und Notch während der postnatalen Myogenese reguliert werden.