New neurons continuously replace dying ones in adult HVC, a forebrain pallial region that is important for song production in adult zebra finches. Despite the ongoing replacement of HVC neurons, zebra finch song remains relatively stable with no evident learning of new syllables. New neurons project to their target (nucleus RA) and respond to auditory stimulation (in anesthetized animals) which suggests that they are functionally integrated into the premotor circuit controlling song production, but this has not been demonstrated directly. We used immediate-early gene (IEG) expression and retrograde tracer injections to track the functional recruitment of new neurons labeled by cell-birth-dating marker 5- bromo-2 ́-deoxyuridine (BrdU) into premotor circuits involved in singing in freely behaving zebra finches. We found that in HVC adult-born neurons at least 3 weeks old express IEGs during singing, as well as in other vocal control areas – Area X and LMAN. This is also the first case to our knowledge when adult-born neurons in LMAN have been documented. Surprisingly, in HVC, IEG expression in new neurons is probably not dependent upon their connectivity to the target region RA, suggesting that these neurons may participate in processing of premotor information through local microcircuitry within HVC before their axons reach RA. However, already at 3 weeks, the population of adult-generated neurons that had been connected to RA by the time of singing were as likely to be activated as the pre-existing HVC-RA projection neurons. Nevertheless, among adult-born HVC cells, the portion of neurons that expressed IEGs and were connected to RA increased with their age from 3 to 8 weeks. Interestingly, we show that social context of singing has an impact on IEG expression in new HVC neurons: At the age of 3 weeks they were more likely to be activated during undirected singing than during directed singing. To analyze requirement of adult neurogenesis for singing in zebra finches, we injected temozolomide (TMZ), the active component of a brain tumor drug, but did not detect any effect on the rates of neurogenesis due to extremely high variability of this parameter in both treated and control conditions. In addition, comparison of expression patterns suggests that FoxP2, a gene linked to human speech and language impairment, and its closest homolog, FoxP1 may interfere with adult neurogenesis by down-regulation of NO pathway, and FoxP1 may be a lineage marker for projection neurons in HVC. Summing up, our results demonstrate that adult-born HVC neurons are activated during vocal production in an age- dependent manner and may contribute specifically to vocal plasticity (minor changes of acoustic parameters of song elements).
Im adulten HVC, einem pallialen Teil des Vorderhirns, welcher essentiell für die Gesangsproduktion adulter Zebrafinken ist, werden kontinuierlich sterbende, alte Neuronen durch neue ersetzt. Trotz dieses ständigen Austauschs von Neuronen in HVC, bleibt der Gesang von Zebrafinken relativ stabil und es werden augenscheinlich keine neuen Silben gelernt. Neue Neuronen projizieren nicht nur zu ihrer Zielregion (Nucleus RA) sondern reagieren auch auf auditorische Stimulation (anästhesierte Tiere). Dies lässt vermuten, dass sie funktionell in die prämotorischen Schaltkreise, die die Gesangsproduktion kontrollieren, integriert sind. Dies wurde bislang nicht experimentell belegt. Wir haben die Expression von „immediate-early“ Genen (IEG) und die retrograde Injektion von Tracern genutzt, um die funktionelle Rekrutierung von neuen, 5-Brom-2 ́- Desoxyuridin (BrdU) markierten Neuronen in die prämotorischen Schaltkreise singender Zebrafinken zu verfolgen. Wir konnten zeigen, dass in neuen, mind. drei Wochen alten, Neuronen die Expression von IEGs durch Singen ausgelöst wurde; dies war der Fall in HVC und auch anderen vokalen Kontrollarealen, AreaX und LMAN. Nach unserem Wissensstand ist dies auch die erste Studie, die adulte Neurogenese in LMAN detektiert. Überraschenderweise scheint die Expression von IEGs in neu geborenen HVC Neuronen nicht von deren Projektion zu ihrer Zielregion RA abzuhängen. Dies könnte ein Hinweis auf die Beteiligung dieser Neuronen bei der Prozessierung von Prämotorinformationen durch die lokalen Mikroschaltkreise innerhalb HVCs sein, zu einem Zeitpunkt bevor die Axone ihr Projektionsziel RA erreichen. Bereits nach drei Wochen ist die Wahrscheinlichkeit einer durch Singen erfolgreichen Aktivierung für die Population der neu geborenen projizierenden Neuronen und die bereits existierenden HVC-RA Projektionsneuronen gleich groß. Nichtsdestotrotz, stieg innerhalb der neu geborenen Neuronen der Anteil an IEG exprimierenden und RA- projizierenden Neuronen mit dem Alter; im Zeitraum von drei bis acht Wochen.Interessanterweise finden wir einen Einfluss des sozialen Gesangskontextes auf die Expression von IEGs in den neu geborenen HVC- Neuronen: Drei Wochen alte Neuronen wurden mit einer größeren Wahrscheinlichkeit durch ungerichteten Gesang, als durch gerichteten Gesang aktiviert. Um die Notwendigkeit adulter Neurogenese für Gesang in Zebrafinken zu untersuchen, haben wir Temozolomid (TMZ), die aktive Komponente eines Medikaments zur Behandlung on Hirntumoren, appliziert. Wir konnten aufgrund der hohen Variabilität der Neurogeneserate keinen Effekt zwischen Behandlungs- und Kontrollgruppe feststellen. Eine Vergleich von Expressionsmustern deutet darauf hin, dass FoxP1 durch Herunterregulation des NO- Signaltransduktionsweges Einfluss auf die Neurogeneserate nehmen könnten. FoxP1 ist das nächste homologe Gen zu FoxP2, welches mit einer menschlichen Sprachstörung in Verbindung gebracht wird. Daneben zeigen wir dass FoxP1 ein Abstammungsmarker für Projektionsneuronen in HVC sein könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Resultate, dass adult geborene HVC-Neurone durch vokaler Produktion altersabhängig aktiviert werden und spezifisch zur vokalen Plastizität beitragen können (minimale Änderungen akustischer Parameter von Gesangselementen).
