EINLEITUNG Die Frühgeborenenretinopathie (Retinopathy of prematurity, ROP) ist eine von Vasoobliteration (Phase I) und anschließender Neovaskularisation (Phase II) geprägte Blutgefäßerkrankung der Netzhaut. Bis zu einem Fünftel aller Erblindungen und Sehschwächen bei Kindern in den Industrieländern werden von der ROP hervorgerufen. Mehr als zwei Drittel aller Frühgeborenen mit einem Geburtsgewicht von weniger als 1251 g entwickeln die ROP. Derzeitige Behandlungsmethoden (z.B. punktuelle Laserbestrahlung der ischämischen Netzhautbereiche, angiostatische Präparate) sind oft verbunden mit einem hohen Grad an Gewebeschädigung, dem Risiko von lokalen sowie systemischen Komplikationen und/ oder Rezidiven. Mit zunehmender Zahl überlebensfähiger Frühgeborener steigt auch das Bedürfnis an besseren und angemesseneren Therapiemöglichkeiten für die ROP. Die schwerwiegendste Komplikation der ROP stellt die Netzhautablösung und damit verbunden der Verlust des Sehvermögens als Folge der pathologischen Neovaskularisation dar. Eine Reihe von Forschungsansätzen postuliert, dass das Komplementsystem zusammen mit Immunzellen die Schlüsselkomponenten bei der Ausbildung der retinalen Neovaskularisation darstellen. Demzufolge verkörpern sie ideale Ansatzpunkte bei der Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Korrelation zwischen dem Komplementsystem und der Entwicklung retinaler Neovaskularisationen unter Einbezug der Interaktion mit den (aktivierten) CD11b-positiven Zellen klarer definieren und daraus neue potentielle Therapieansätze identifizieren zu können. Die konkreten Ziele waren die Beantwortung folgender Fragestellungen: 1\. Kann die C5a-C5aR-Achse des Komplementsystems die Ausbildung der retinalen Vasoobliteration und Neovaskularisation der ROP beeinflussen? 2\. Korreliert das räumliche Verteilungsmuster der retinalen CD11b-positiven Zellen mit der Zone der retinalen Neovaskularisation (Tuft-Zone) unter der Hypothese, dass aktivierte CD11b-positive Zellen vor allem in der Tuft-Zone vorkommen? Ist dieses Verteilungsmuster von dem Komplementfaktor C5a beeinflussbar? 3\. Führt das Mausmodell der OIR per se zu einer erhöhten Komplementaktivität. Ist eine Beeinflussung der Komplementaktivität durch C5a möglich? METHODEN Das Mausmodell der Sauerstoff-induzierten Retinopathie (Oxygen-induced retinopathy, OIR) ist ein etabliertes Tiermodell, das die neovaskulären Charakteristika der humanen Frühgeborenenretinopathie zuverlässig imitiert. Die vorliegende Studie bedient sich diesem Tiermodell, um die Hypothesen zu untersuchen. Neonatalen OIR-Mäuse wurden vom postnatalen Tag (P)12 bis P16 täglich intraperitoneale Injektionen mit C5a, C5a-Inhibitor oder reiner Vehikelflüssigkeit (Kontrolle) verabreicht. Für die Untersuchung der Komplementaktivität wurden ergänzend reine OIR-Mäuse (ohne Injektionsbehandlung) und unter durchgehend normoxischen Bedingungen gehaltene Mäuse genutzt. Die Mäuse wurden an P14, P17 und P21 zur Probengewinnung geopfert. Immunhistochemie und retinale Flachpräparate dienten der Analyse: 1) des Ausmaßes der retinalen Vasoobliteration (avaskuläre Bereiche) und 2) der Neovaskularisation (Tufts), und 3) des quantitativen Verteilungsmusters der (aktivierten) CD11b-positiven Zellen bezüglich der avaskulären, Tuft- und physiologisch vaskularisierten Zonen. Darüber hinaus wurden retinale Genexpressionsanalysen verschiedener Komplementfaktoren mittels quantitativer PCR durchgeführt. ERGEBNISSE Die C5a-Supplementierung führte zu einem signifikant reduzierten Ausmaß der retinalen Vasoobliteration und Neovaskularisation im Vergleich zur Kontrollgruppe. In der avaskulären Zone waren gruppenübergreifend signifikant weniger CD11b-positive Zellen als in der vaskulären (P14 und P17) und als in der Tuft-Zone (P17). Unabhängig von der Behandlung war die Anzahl der aktivierten CD11b-positiven Zellen in der avaskulären (P14 und P17) und in der Tuft-Zone (P17 und P21) signifikant höher verglichen mit den physiologisch vaskularisierten Regionen. Die C5a- Supplementierung hat sowohl die Gesamtzellzahl (P17 und P21) als auch die Zahl der aktivierten Zellen (P14 und P17) in den pathologisch vaskularisierten Zonen (avaskuläre und Tuft-Zone) im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant reduziert. Die Komplementaktivität war im Rahmen der OIR erhöht und konnte nicht durch C5a-Supplementierung beeinflusst werden. Die C5a-Inhibierung hatte keinen Einfluss auf die retinale Vasoobliteration oder Neovaskularisation; das räumliche Verteilungsmuster der (aktivierten) CD11b-positiven Zellen konnte zu wenigen Zeitpunkten beeinflusst werden, wobei die Effekte mit denen der C5a- Supplementierung vergleichbar waren. Die C5a-Injektionen führten zu einer schnelleren Revaskularisation der avaskulären Zone und schnelleren Regression der retinalen Tufts in Korrelation mit einer Reduktion CD11b-positiver Zellen. Die bereits bekannten pro- und anti-angiogenen Effekte des Komplements unterstützten die Ergebnisse der vorliegenden Studie. Die „Zielort-fern“ gesetzten intraperitonealen Injektionen können einen starken Entzündungsreiz im Peritoneum hervorgerufen haben, der eine stärkere Aktivierung des Komplementsystems sowie einen stärkeren Rekrutierungsreiz für die CD11b- positiven Zellen verursacht haben könnte als die gleichen lokal durch die OIR im Auge ausgelösten Stimuli. Die angewandte Methodik könnte demnach zur reduzierten Zellzahl und Komplementaktivität in der Netzhaut beigetragen haben. Das vermehrte Vorkommen der (aktivierten) CD11b-positiven Zellen in den pathologisch vaskularisierten Zonen spricht für eine Beteiligung dieser Zellen an der retinalen Blutgefäßbildung. Die wenigen beobachteten Effekte der C5a- Inhibierung könnten in einer verringerten Zellrekrutierung an den Injektionsort ausgelöst durch eingeschränkte C5a-bedingte Immunzellrekrutierung und/ oder einer methodischen Schwäche der Studie begründet sein. SCHLUSSFOLGERUNG Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass das aktivierte Komplementsystem und insbesondere die C5a-C5aR- Achse das Potential hat, die im Rahmen des Mausmodells der OIR entwickelte retinalen Neovaskularisation signifikant zu hemmen. Eine Beteiligung der CD11b-positiven Zellen erscheint dabei als wahrscheinlich. Eine zukünftige Studie mit intravitrealen Injektionen (lokale anstatt systemischer Applikation) könnte die in der vorliegenden Studie gewonnenen Erkenntnisse um wertvolle Informationen erweitern. Dennoch deuten die Ergebnisse der vorliegenden Studie darauf hin, dass der aktivierte Komplementfaktor C5a einen potentiellen neuen therapeutischen Angriffspunkt darstellt, der im Rahmen der Entwicklung neuer Behandlungsstrategien der ROP berücksichtigt werden sollte.
INTRODUCTION Retinopathy of prematurity (ROP) is a vascular disease of the retina characterized by vaso-obliteration (phase I) and, subsequently, neovascularisation (phase II). In the industrialized countries up to one-fifth of all blindness and visual impairment among children are caused by ROP. More than two thirds of the premature infants weighing less than 1251g at birth develop ROP. Current treatment methods (e.g. selective laser irradiation of the ischemic retinal areas, angiostatic medication) are often associated with a high degree of tissue damage, the risk of local as well as systemic complications and/ or recurrences of the disease. As the number of premature infants capable of surviving increases, there is a rising need of better and more adequate therapies for ROP. The most severe complication of ROP is retinal detachment and hence loss of vision as a consequence of pathological neovascularisation. Several lines of research argue that the complement system, together with immune cells, are the key contributors to the retinal neovascularization. Thus they are ideal candidates to take into account in the development of new therapeutic strategies. The aim of the present study was to correlate the complement system with the development of retinal neovascularisation, also taking into consideration the interaction with the (activated) CD11b-positive cells, in order to identify potential new therapeutic approaches. The specific objectives were: 1\. Can the C5a-C5aR axis of the complement system influence the formation of retinal vaso- obliteration and neovascularisation in ROP? 2\. Does the spatial distribution pattern of the retinal CD11b-positive cells correlate with the zone of retinal neovascularisation (tuft zone), with activated CD11b-positive cells mainly found in the tuft zone? Can this distribution pattern be influenced by the complement factor C5a? 3\. Does the OIR mouse model per se lead to increased complement activity? Is it possible to influence the complement activity by C5a action? METHODS Oxygen-induced retinopathy (OIR) is a well-established mouse model that mimics the main neovascular characteristics of ROP in humans. The present study employed this animal model to investigate the hypotheses. Neonatal OIR mice were treated with daily intraperitoneal injections of C5a, C5a inhibitor or vehicle control from postnatal day (P)12 to P16. Additionally, for the study of the complement activity, pure OIR mice (no injection treatment) and mice kept under normoxic conditions at all times were used. The mice were sacrificed at P14, P17 and P21. Immunohistochemistry and retinal whole-mounts served to analyse: 1) the extent of retinal vaso- obliteration (avascular areas) and 2) neovascularisation (tufts), and 3) the quantitative distribution pattern of the (activated) CD11b-positive cells with respect to the avascular, tuft and physiologically vascularized zones. In addition, retinal gene expression analyses of different complement factors were performed by means of quantitative PCR. RESULTS C5a supplementation led to a significantly reduced extent of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in comparison to the control group. All groups presented significantly less CD11b-positive cells in the avascular zone when compared to the physiologically vascularized (P14 and P17) and the tuft zones (P17). Independently of the treatment, the number of activated CD11b-positive cells was significantly higher in the avascular (P14 and P17) and in the tuft zone (P17 and P21) when compared to physiologically vascularized regions. C5a supplementation significantly reduced the total number of CD11b-positive cells (P17 and P21), as well as the number of activated cells among them (P14 and P17) in the pathologically vascularized zones (avascular and tuft zone) when compared to control. The complement activity was increased in the context of OIR and could not be influenced by C5a supplementation. C5a inhibition had no effect on retinal vaso-obliteration or neovascularisation. The spatial distribution pattern of the (activated) CD11b-positive cells was influenced by C5a inhibition at few time points, the effects being comparable to those of C5a supplementation. The C5a injections resulted in a faster re- vascularisation of the avascular zone and in a faster regression of the retinal tufts; this was correlated with a reduction in CD11b-positive cells. The already known pro- and anti-angiogenic effects of the complement supported the results of the present study. The intraperitoneal injections, placed far off the target location (of the retina), may have caused a strong inflammatory stimulus in the peritoneum which may have created a stronger activation of the complement system, as well as a stronger recruitment stimulus for the CD11b- positive cells compared to the same local stimuli induced by the OIR in the eye. The applied methodology could thus have contributed to the reduced cell count and complement activity in the retina. The increased occurrence of the (activated) CD11b-positive cells in the pathologically vascularized zones indicates an involvement of these cells in the retinal angiogenesis. The few observed effects of C5a inhibition could be due to reduced cell recruitment to the injection site by inhibited C5a-induced immune cell recruitment and/ or methodological pitfalls of the study. CONCLUSION The results of the present study show that the activated complement and in particular the C5a-C5aR axis has the potential to significantly inhibit retinal neovascularisation developed in the OIR mouse model. An involvement of the CD11b-positive cells in the time-course of this appears to be likely. A future study with intravitreal injections (local application instead of systemic) could enrich the findings gained in the present study with valuable information. Nevertheless, the results of the present study suggest that the activated complement factor C5a is a potential new therapeutic target that could be taken into account in the development of new treatment strategies of ROP.