Einzelmolekül-Spektroskopie am Photosystem I

Abstract

Im Antennensystem von Photosystem I (PS I) existiert eine kleine Gruppe Chlorophylle, deren optische Übergangsenergien gegenüber der erforderlichen Anregungsfrequenz des Reaktionszentrums (RC) rotverschoben liegen. Sie werden daher allgemein als "rote Chlorophylle" bezeichnet. Sie übernehmen eine Schlüsselrolle in der PS I-Forschung. Weder ihre Funktion in der Natur, noch der Mechanismus, der zu ihrer Rotverschiebung führt, sind endgültig geklärt. Bei kryogener Temperatur stellen die roten Chlorophylle für die Anregungsenergie eine Falle dar, denn zum Energieübertrag auf das RC fehlt die vibronische Energie in der Proteinmatrix, die unter physiologischen Bedingungen genutzt wird. Die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute ermöglicht der Einzelmolekül-Spektroskopie (SMS) den Zugang zum System. Ihr Vorteil gegenüber konventionellen Spektroskopiemethoden besteht darin, dass die Mittelung über ein Ensemble vermieden wird. Um mit SMS die roten Pigmente im PS I zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein konfokales Spektrometer aufgebaut, das die Fluoreszenz einzelner Moleküle bei 1,4 K messen kann. Als Proben für die Ergebnisse in dieser Schrift dienten cyanobakterielle PS I-Komplexe der Organismen Thermosynechococcus elongatus (T. elongatus), Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002. In der Literatur wurden die roten Chlorophylle der PS I von T. elongatus und Synechocystis mittels Gaußscher Zerlegung der Ensemble-Absorptionsspektren in Pigment-Verbände unterteilt. Entsprechend den spektralen Positionen der Maxima bei 708 nm und 719 nm wurden die Verbände im PS I von T. elongatus als C708 und C719 bezeichnet und analog im PS I von Synechocystis als C706/C708 und C714. Ein Ergebnis dieser Arbeit ist die Bestimmung der Anzahl der roten Emitter im PS I von T. elongatus. Diese konnte mit Hilfe einer spektral aufgelösten Polarisationsanalyse der Fluoreszenz von Monomeren auf drei festgelegt werden. Mindestens einer dieser roten Zustände kann je nach selektiertem Komplex im Spektralbereich des C708- oder des C719-Verbands emittieren. Bei den PS I aller drei Spezies wurden im Spektralbereich der jeweiligen roten Chlorophylle scharfe Null-Phononen-Linien (ZPLs) beobachtet. Demnach konnten erstmals ZPLs beim PS I von Synechocystis beobachtet werden. Dadurch wurden die Schlussfolgerungen einer kürzlich veröffentlichten Arbeit, in der das Auftreten von ZPLs bestritten wurde, widerlegt. Während die ZPLs vom PS I von T. elongatus zwei spektral voneinander getrennte Bänder in den spektralen Regionen der Verbände C708 und C719 bilden, treten die ZPLs vom PS I von Synechocystis in den Bereichen der Verbände C706/C708 und C714 auf, ohne klare Separation voneinander. Beim PS I von Synechococcus sp. PCC 7002 liegt der größte Teil der aufgetretenen ZPLs in einem Band mit mittlerer Lage bei λ ≈ 698 nm. Der zugehörige Chlorophyll-Verband wurde daher als F698 bezeichnet. Für die ZPLs der PS I aller drei Spezies ist eine starke spektrale Diffusion charakteristisch. Sie wird auf strukturelle Fluktuation in der Proteinbindungstasche der roten Chlorophylle zurückgeführt, die zu Veränderungen in der Stärke der lokalen Wechselwirkungen führen und somit zu Fluktuationen der optischen Übergangsenergien. Beim PS I von T. elongatus wurde festgestellt, dass sich die Korrelation zwischen der Fluktuationsrate und der spektralen Sprungweite der ZPLs in voneinander separierte Bereiche aufteilen lässt. Dieses Ergebnis passt zum Bild einer in hierarchischen Rängen organisierten Energielandschaft, in der die mittlere Barrierenhöhe von oben nach unten abnimmt. Im Vergleich wurden hingegen beim PS I der Spezies Synechocystis zunächst keine voneinander separierten Bereiche in der Korrelation zwischen Fluktuationsrate und spektraler Sprungweite der ZPLs gefunden. Der Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium im Lösungsmittel hat bei den PS I beider Organismen zu einem signifikanten Deuteriumeffekt geführt. Er äußerte sich in einer Verringerung der spektralen Fluktuationen in der Fluoreszenz. Das spricht dafür, dass die Positionsänderung von Protonen einer der Hauptprozesse ist, mit denen im PS I die lokalen optischen Übergangsenergien der Pigmente feinabgestimmt werden. Ein interessanter Bestandteil des Deuteriumeffekts beim PS I von Synechocystis ist die häufige Erzeugung von Bi- bzw. Tristabilitäten. Diese können durch die herabgesetzte Tunnelwahrscheinlichkeit eines Deuterons im Vergleich zu der eines Protons erklärt werden. Durch einen indirekten Nachweis wurde gezeigt, dass spektrale Sprünge von ZPLs über 10 cm-1 bei 1,4 K erst durch die Einstrahlung von Energie wahrscheinlich werden. Daher scheinen unter kryogenen Bedingungen Tunnelprozesse von Protonen in der unmittelbaren Proteinumgebung der roten Pigmente ohne äußere Anregung sehr unwahrscheinlich. Durch den Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium im Lösungsmittel ließ sich interessanterweise beim PS I von Synechocystis die Korrelation zwischen der Fluktuationsrate und der spektralen Sprungweite der ZPLs, wie beim PS I von T. elongatus ohne entsprechenden Austausch, in voneinander separierte Bereiche aufteilen. Ein Auswerteverfahren zum Ausgleich von spektraler Diffusion wurde dazu genutzt, um einen großen Teil der zeitlichen Mittelung im Fluoreszenzsignal einzelner PS I-Komplexe zu eliminieren. Dadurch konnten aus den Spektrensequenzen der PS I aller drei Spezies spektrale Profile von roten Zuständen nahe der homogenen Linienformen exzerpiert werden. Theoretisch lässt sich die Linienform eines Pigments in einem Proteinkomplex durch die Spektraldichte beschreiben. Zur Simulation der Linienform wurde ein Algorithmus verwendet, der die Pigment- Protein-Kopplung mit der Näherung, dass die Fluktuation der Übergangsenergie linear von der Auslenkung der Kerne aus ihrer Gleichgewichtslage abhängt, und mit der Annahme einer lorentzförmigen Spektraldichte iterativ berechnet. Bei den PS I aller drei oben genannten Spezies wurden selbst für stark rotverschobene Zustände überraschend kleine Huang-Rhys-Faktoren festgestellt, was bedeutet, dass die elektronischen Übergänge nur schwach an die inter- und intramolekularen vibronischen Freiheitsgrade koppeln. Dieses Ergebnis erweitert das Bild der roten Zustände auf die Weise, dass für ihre starke Rotverschiebung keine starke Elektron-Phonon-Kopplung notwendig ist. Als alternative Ursache wurde die Anhebung der exzitonischen Aufspaltung durch einen hohen Beitrag des Dextermechanismus vorgeschlagen. Um zu untersuchen, ob verschiedene rote Zustände innerhalb eines PS I-Komplexes über Energietransfer (ET) miteinander in Verbindung stehen, wurde das Korrelationsverhalten der Fluoreszenz von unterschiedlichen roten Emittern analysiert. Mehrfach aufgetretene Antikorrelationen bei sowohl dem PS I von T. elongatus als auch dem PS I von Synechocystis weisen darauf hin, dass die roten Zustände jeweils entweder direkt über ET miteinander verbunden sind, oder dass sie getrennt voneinander über ET mit einem Pigment-Verband aus den Antennenpigmenten verbunden sind. Auch eine Mischung aus beiden Konfigurationen ist denkbar. Beim PS I von T. elongatus wurde zusätzlich mittels einer Polarisationsanalyse an einzelnen Monomeren festgestellt, dass die Übergangsdipolmomente der Emitter vom C708 und C719 in einem Winkel nahe 90° zueinander stehen. Demnach würde man im Falle eines direkten ETs zwischen den beiden Verbänden erwarten, dass bei einer Anregung mit linear polarisiertem Licht mit einer Wellenlänge von ~712 nm die Polarisation der Fluoreszenz einen großen Anteil enthält, der nicht der Polarisation des eingestrahlten Lichts entspricht. Dieses Verhalten geht aus einer Anisotropiestudie am Ensemble hervor. Daher wird ein effizienter direkter ET zwischen Zuständen des C708- und C719-Verbands innerhalb eines Monomers für wahrscheinlich gehalten.

A confocal spectrometer for low temperatures with sufficient efficiency to detect single-molecule fluorescence was built in the course of this work. It was used to investigate spectral properties, heterogeneities and dynamics of the low-energy antenna chlorophylls in individual Photosystem I (PS I) complexes from three different cyanobacteria: Thermosynechococcus elongatus (T. elongatus), Synechocystis sp. PCC 6803 and Synechococcus sp. PCC 7002. A fluorescence polarization analysis on single PS I monomers from T. elongatus reveals three pigment pools contributing to the red-shifted emission. In addition, the angle between the transition dipole moments of emitters from C708 and C719 were determined to be near 90°. In the spectral regions of the red-most states of all three species intense zero-phonon lines (ZPLs) were observed showing marked spectral diffusion. A clear effect due to the substitution of hydrogen for deuterium in the solvent was discovered, visible as significant reduction of spectral fluctuations. This suggests that proton displacement is one of the main processes responsible for fine-tuning of site energies in PS I. The occurrence of spectral jumps of ZPLs above 10 cm-1 in absence of external excitation was proved to be highly unlikely at 1.4 K. Consequently, at cryogenic temperatures proton tunneling in the vicinity of the red pools is very unlikely without excitation. Even for far red-shifted states of the PS I from all of the three above-mentioned species small Huang- Rhys factors were found, implying only a weak coupling of the electronic transition to the bath of vibrational modes. This finding indicates that no distinct electron-phonon coupling is necessary for the strong redshift of these states.