Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, das Verhalten von ß-Catenin während der frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung, insbesondere während des kritischen 8-Zellstadiums, näher zu analysieren, um Hinweise auf eine mögliche Funktion von ß-Catenin während dieser Entwicklungsphase zu erhalten. Hierzu wurden neben der Höhe des Gesamtproteinlevels von ß-Catenin auch dessen Phosphorylierungsstatus sowie das Verteilungsmuster von Gesamt-ß-Catenin (GBC) und phosphoryliertem ß-Catenin betrachtet. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf N-PBC (an Ser33/Ser37/Thr41 phosphoryliertes ß-Catenin), dessen Funktion durch den Einsatz eines GSK3-Inhibitors noch genauer untersucht werden sollte. Darüber hinaus wurden zusätzlich das Proteinlevel und die Lokalisation von C-PBC (an Ser552 phosphoryliertes ß-Catenin) betrachtet. FRAP-Analysen von YFP-markiertem ß-Catenin dienten der Analyse von Translokationsprozessen innerhalb des Embryos. Auf diese Weise sollte das Wissen bezüglich der grundlegenden Mechanismen, die während der in diesem Zeitraum stattfindenden embryonalen Genomaktivierung und der folgenden ersten Differenzierungsprozesse eine Rolle spielen, verbessert werden. Durch eine Erweiterung des Wissens auf diesem Gebiet könnte ein Beitrag geleistet werden, langfristig die Technik der In-vitro-Produktion boviner Embryonen zu verbessern. ß-Catenin war vom 4-bis zum 16-Zellstadium in konstant hohen Proteinlevels nachweisbar und stammt somit aus maternaler und embryonaler Genaktivität. In den untersuchten Entwicklungsstadien war es nur in geringem Maß an Ser33/Ser37/Thr41 phosphoryliert. Allerdings zeigte der gegen N-PBC gerichtete Antikörper im Westernblot zusätzlich ein deutliches Signal mit NIP, einem noch nicht näher identifizierten Protein von geringerem Molekulargewicht. Hierbei könnte es sich um ein phosphoryliertes Splicing-oder Spaltprodukt oder um ein von ß-Catenin völlig unabhängiges Protein handeln. Da bei der Analyse des Verteilungsmusters nicht zwischen NIP und N-PBC unterschieden werden konnte, beziehen sich die diesbezüglichen Angaben auf beide Proteine, die hierfür unter der Bezeichnung SHEP (Summe homologer Epitope aufweisender Phosphoproteine) zusammengefasst wurden. C-PBC schien in größeren Mengen vorhanden zu sein als N-PBC. In den untersuchten bovinen Präimplantationsembryonen lag GBC überwiegend membranständig vor. Ein geringerer Anteil befand sich im Zytoplasma, wobei hier eine im Entwicklungsverlauf zunehmende perinukleäre Verdichtung (Corona) auszumachen war. In sehr kleinen Mengen war ß-Catenin auch im Zellkern zu finden. Die durchgeführten FRAP-Analysen zeigten, dass es im Lauf der präimplantatorischen Embryonalentwicklung zu einer Translokation von zytoplasmatischem ß-Catenin in den Zellkern kam, was auch in Zusammenhang mit der perinukleären Verdichtung stehen könnte. Überraschenderweise schienen sich überwiegend die phosphorylierten Varianten von ß-Catenin, SHEP und C-PBC, im Zell¬kern anzureichern. Dies widerspricht der am nächsten liegende Vermutung, dass ß-Catenin unter dem Einfluss von Wnt-Signalen in den Zellkern transloziert, da in diesem Fall an den Aminosäureresten Ser33, Ser37 und Thr41 hypophosphoryliertes ß-Catenin zu erwarten wäre. Dennoch spricht die Tatsache, dass die Phosphoproteine offensichtlich im Zellkern akkumulierten und sich bezüglich ihrer Lokalisation dabei zunehmend auf bestimmte Kernbereiche konzentrierten (Bildung von nuclear bodies), dafür, dass sowohl SHEP als auch C-PBC eine physiologische Funktion während der frühesten Embryonalentwicklung innehaben könnten. Der Einsatz des GSK3-Inhibitors führte nicht zu dem erwarteten Rückgang des N-PBC-Levels und der damit in Zusammenhang stehenden Akkumulation von dephosphoryliertem ß-Catenin. Eine derartige Stimulierung des Wnt-Signalwegs ist aus ähnlichen Versuchen an somatischen Zellen bekannt. Nichts desto trotz waren unter Inhibitoreinfluss gewisse Effekte sichtbar, insbesondere, was das Verteilungsmuster von GBC und SHEP betrifft. So kam es zu einer Verringerung des nukleären SHEP-Levels verbunden mit einem Rückgang des Anteils von Embryonen mit nuclear bodies und Corona. Dies deutet darauf hin, dass GSK3 auch bei frühesten Entwicklungsstadien bereits eine funktionelle, allerdings vom Wnt-Signalweg vermutlich unabhängige Rolle spielt. Insgesamt deutete sich an, dass es um den Zeitpunkt der embryonalen Genomaktivierung herum in bovinen Embryonen zu interessanten, jedoch teils unerwarteten und noch nicht abschließend erklärbaren Phänomenen das Verhalten von ß-Catenin betreffend kommt. Gleichwohl scheint dieses Protein durchaus eine Rolle in dieser frühen Entwicklungsphase zu spielen. Um diesbezüglich genauere Interpretationen zu ermöglichen, sind im Rahmen zukünftiger Forschungsarbeiten detailliertere Untersuchungen, insbesondere unter Einbeziehung weiterer Signalkaskaden, nötig.
The purpose of this research project was to investigate the characteristics of ß-catenin during early preimplantation development, especially during the critical 8-cell stage, in order to get information about a possible function of ß-catenin during this phase of development. For this, we considered the protein level of ß-catenin as well as its phosphorylation status and the distribution pattern of total ß-catenin and phosphorylated ß-catenin. In this process, the main focus of attention was on N-PBC (ß-catenin phosphorylated at Ser33/Ser37/Thr41), whose function should be analysed more deeply by using a GSK3-inhibitor. In addition, the protein level and localization of C-PBC (ß-catenin phosphorylated at Ser552) was considered. To investigate processes of translocation of ß-catenin within the embryo, FRAP-analyses of YFP-tagged ß-catenin were performed. Thereby, the knowledge about basic machanisms that are important during embryonic genome activation and the following first processes of differentiation should be improved. By augmenting the knowledge within this sector, it could be possible to make a contribution to an improvement of in-vitro-production of bovine embryos in the long run. Non- varying protein levels of ß-catenin were detectable from the 4- to the 16-cell stage. Thus ß-catenin was both of maternal and embryonic origin. In embryos of the investigated developmental stages, it was phosphorylated at Ser33/Ser37/Thr41 only to a minor degree. However, in the Western blot, the anti-N-PBC antibody additionally showed a clear reaction with NIP, a still unidentified protein of lower molecular weight. This protein might be a phosphorylated cleavage-or splicing-product or another protein that is completely independent of ß-catenin. Concerning the analysis of the distribution pattern, it was not possible to distinguish between NIP and N-PBC. Thus, the statements made in this regard refer to both proteins. Therefore, we introduced the term SHEP that includes both NIP and N-PBC. C-PBC seemed to be detec¬table in higher quantities than N-PBC. Within the invastigated preimplantation embryos, ß-catenin was localized mainly at the cell membrane. A lesser fraction was found in the cytoplasm, where an increasing perinuclear aggregation (corona) could be observed in the course of development. Diminutive amounts of ß-catenin could also be detected in the nucleus. The FRAP-analyses showed a translocation of ß-catenin from the cytoplasm to the nucleus in the course of preimplantation development, which could be associated with its perinuclear aggregation. Surprisingly, mainly the phosphorylated forms of ß-catenin, SHEP and C-PBC, seemed to accumulate in the nucleus. This is contrary to the most obvious assumption that ß-catenin is translocated into the nucleus in the context of wnt-signaling, as in this case, ß-catenin that is hypophosphorylated at Ser33, Ser37 and Thr 41 would be expected. Nevertheless, the fact that the phosphoproteins apparently accumulate in the nucleus and thereby concentrate their localization on specific nuclear regions (formation of nuclear bodies) indicates that both SHEP and C-PBC could play a physiological role in the nucleus during earliest embryonic development. The application of the GSK3-inhibitor has not led to the expected decline of the protein level of N-PBC and to the associated accumulation of dephosphorylated ß-catenin. Such a stimulation of the wnt- signaling pathway is known from comparable experiments with somatic cells. Nevertheless, under the influence of the inhibitor, certain effects could be seen, especially concerning the distribution pattern of total ß-catenin and SHEP. This implies a diminished level of nuclear SHEP as well as a reduced proportion of embryos with nuclear bodies or a corona. This suggests that, also in embryos of early developmental stages, GSK3 already plays a functional part, that, however, probably is independent of the wnt-signaling pathway. All in all, it seems that around the time of embryonic genome activation, interesting, but partly unexpected and not completely explainable phenomena concerning the properties of ß-catenin are taking place in bovine embryos. Nevertheless, this protein seems to have a function in this early phase of development. To enable more precise interpretations in this regard, more detailed investigations, especially the consideration of further signaling cascades, would be necessary.
