Myosin VI is a molecular motor that can walk processively on actin filaments with a 36 nm step size. The walking mechanism of myosin VI is controversial because it takes very large steps without an apparent lever arm of required length. Therefore, myosin VI has been argued to be the first exception to the widely established lever arm theory. It was therefore critical to directly demonstrate whether this motor walks hand-over-hand along actin in spite of its short lever arm. In the present work the displacement of a single myosin VI head was followed during the stepping process. A single head is displaced 72 nm during stepping, while the center of mass previously has been shown to move 36 nm. Thus, this result provides strong evidence for a hand-over-hand walking mechanism. The existence of a flexible element is hypothesized that would allow the motor to bridge the observed 72 nm distance. We established a new technique termed single molecule high resolution colocalization (SHREC) that allows the measurement of interfluorophore distances below the diffraction limit of the fluorophore s emitted light. To this end, two chromatically different fluorescent dyes were used as probes. The probes were imaged separately, and their centroids were localized individually with nanometer precision. Subsequently, the fluorophores positions were mapped onto the same space, which allowed the determination of the distance between them. With a lower resolution limit of ~10 nm, SHREC is a tool that can measure distances at scales between the upper resolution limit of single molecule FRET (~10 nm) and the lower resolution limit of fluorescence microscopy (~250 nm). The capability of SHREC was tested using the processive myosin V molecular motor. With its lever arms, myosin V walks hand-over-hand along actin. This mechanism predicts, similar to myosin VI, an alternation of the catalytic heads which we directly visualized with SHREC by labeling a motor s two lever arms with two different fluorophores. As predicted by the hand-over-hand model, we observed the fluorophores alternate positions as the motor walked along actin. The actin activated ATPase activity of full-length Dictyostelium myosin II is stimulated 6-fold upon reversible phosphorylation of its regulatory light chain (RLC). In contrast, the ATPase of the single headed S1 is activated regardless of the phosphorylation state of the RLC. The molecular mechanism of the regulation has remained unclear because the RLC is topographically far removed from the catalytic domain in available crystal structures. Unexpectedly, we observed the RLC crosslink to the catalytic domain in the single headed Dictyostelium myosin S1, suggesting an interaction between the RLC and S1. We also observed that phosphorylation of the RLC inhibited this crosslinking. The increased interactions between the head and the neck in the unphosphorylated state suggests a more bent conformation of the protein, as was seen in the unphosphorylated smooth muscle myosin II in electron microscopy experiments. The phosphorylation state dependent conformational change in the Dictyostelium Myosin S1 combined with previous structural information suggests a model for the regulation of the actin activated ATPase activity. In this model, dephosphorylation of the RLC favors a conformation in which the head cannot bind actin productively due to steric hindrance in the context of the full-length molecule.
Myosin VI ist ein molekularer Motor, der mehrere 36 nm lange Schritte auf Aktinfilamenten nehmen kann. Der Laufmechanismus von Myosin VI ist jedoch umstritten, weil der Motor grosse Schritte nehmen kann, ohne die dafür erforderliche Hebelarmlänge zu besitzen. Daher wurde Myosin VI als erste Ausnahme der weitgehend etablierten Hebelarmtheorie angesehen. Es war demnach wichtig zu zeigen, ob Myosin VI trotz seines kurzen Hebelarms hand-over-hand auf Aktinfilamenten laufen kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ein einzelner Kopf um 72 nm versetzt wird, sobald sich das Protein einen Schritt auf Aktin vorwärts bewegt. Weil diese Distanz der doppelten Schrittweite des Massezentrums von Myosin VI (36 nm) entspricht, demonstriert dieses Ergebnis, dass Myosin VI hand-over-hand auf Aktin läuft. Die Versetzung eines Kopfes um 72 nm impliziert die Existenz eines mechanisch dehnbaren Elements, das die Überbrückung der Distanz zwischen zwei Köpfen ermöglicht. Eine neue Technologie namens Single molecule High REsolution Colocalization (SHREC) wurde etabiliert, die es erlaubt, Distanzen zwischen zwei Fluorophoren in Makromolekülen unter der beugungsbegrenzten Auflösung des emitierten Lichts zu bestimmen. Hierbei wurden zwei spektral nicht überlappende Fluorophore verwendet. Diese wurden separat detektiert und deren Zentrum mit Nanometer Präzision einzeln lokalisiert. Anschlieβend wurden die Fluoreszenzzentren aufeinander projiziert und die Distanz zwischen ihnen bestimmt. Die SHREC Technologie kann mit einer unteren Auflösungsgrenze von ~10 nm die spektroskopische Kluft zwischen Einzel-Molekül FRET (~10 nm) und der beugungsbegrenzten Fluoreszenzmikroskopie (~250 nm) überbrücken. Das Potential dieser neuen Technologie wurde an dem prozessiven Myosin V Protein getestet. Myosin V kann mit seinen langen Hebelarmen hand-over-hand auf dem Aktinfilament laufen. Das Modell sagte ein periodisches Alternieren der Myosin V Köpfe während des Laufens vorher, das mit Hilfe der SHREC Technologie durch Markierung der beiden Köpfe mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren direkt beobachtet werden konnte. Die reversible Phosphorylierung der regulatorischen Seitenkette (RLC) vom Wildtyp Dictyostelium Myosin II führt zu einer sechsfachen Stimulierung seiner Aktin-aktivierten ATP Hydrolyse. Im Gegensatz dazu ist diese Hydrolyse Aktivität der freien Köpfe (S1) unabhängig von der RLC Phosphorylierung. Der molekulare Mechanismus dieser Regulierung ist unbekannt, weil in den bekannten Kristallstrukturen die RLC weit entfernt von der katalytischen Domäne angeordnet ist. Es wurde im Rahmen dieser Arbeit eine unerwartete Interaktion zwischen dem Kopf und der RLC im Dictyostelium Myosin S1 entdeckt. Zudem wirkte die RLC Phosphorylierung inhibierend auf die Kopf- RLC Wechselwirkung. Eine erhöhte Interaktion zwischen dem Kopf und der RLC im unphosphoryliertem Zustand deutet auf eine gekrümmte Konformation hin wie sie auch für das unphosphorylierte Myosin II im glatten Muskel im Elektronenmikroskop beobachtet wurde. Die vom Phosphorylierungszustand abhängige Konformationsänderung zusammen mit Strukturinformationen aus früheren Studien, führte zu der Aufstellung eines Modells, das die RLC regulierte Aktinstimulierung der ATP Hydrolyse von Dictyostelium Myosin erklärt. In diesem Model führt die Dephosphorylierung der RLC zu einer Konformation des Wildtyp Proteins, die sterisch die Bindung von Aktin an Myosin behindert. Die Aktin Bindung von freien S1 Köpfen wird im Gegensatz dazu durch diese Konformationsänderung nicht beeinflusst.
