EINLEITUNG Der Zusammenhang von veränderten intestinalen Mikrobiota und chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wird seit langem diskutiert. Neben einer verringerten bakteriellen Diversität konnte auch die Zunahme einzelner Bakteriengruppen diesen Erkrankungen zugeordnet werden. Die Rolle einer möglicherweise kolitogenen Mikrobiota ist in diesem Zusammenhang jedoch weiter unklar. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass α-Hämolysin (HlyA)-produzierende Escherichia coli (E. coli) an einem Enterozytenzellmodell Läsionen, so genannte Focal Leaks, induzieren können. Daher sollte in dieser Arbeit eine intestinale Kolonisation mit HlyA-produzierenden Bakterien in einem in vivo Modell untersucht und ihr möglicher Einfluss auf CED geprüft werden. METHODEN Mukosa-assoziierte, Mukus-assoziierte und intraepitheliale Bakterien, die aus Kolonbiopsien von Patienten mit CED und Darmgesunden gewonnen wurden, wurden mittels Bakterienkultur untersucht. In der quantitativen real-time PCR (qPCR) wurde kulturunabhängig die Konzentration HlyA-produzierender Bakterien bestimmt. In Kolonisationsversuchen wurde an Wildtyp-, Interleukin-10-defizienten und monoassoziierten Mäusen der Effekt HlyA-produzierender E. coli 536 und HlyA- defizienter E. coli 536 Mutanten (HDM) untersucht. Die Auswirkungen der Kolonisation wurden in klinischen, histopathologischen und elektrophysiologischen Untersuchungen erfasst. Die Darstellung von Focal Leaks erfolgte mittels konfokaler Laser-Scanning Mikroskopie. Darüber hinaus wurden in vitro im HT-29/B6- Kolonepithelzellmodell Möglichkeiten der HlyA-Inhibierung mit freien Zinkionen geprüft. ERGEBNISSE In der Bakterienkultur aus Biopsieproben konnte eine tendenzielle Zunahme hämolysierender Bakterien bei Patienten mit Colitis ulcerosa (CU) im entzündlichen Schub beobachtet und ein vermehrter bakterieller Übertritt durch die Darmbarriere aufgezeigt werden. In den qPCR- Untersuchungen wurde in einem Großteil der Proben von Patienten mit CED und Darmgesunden das Vorhandensein von UPEC-Typ HlyA nachgewiesen. Jedoch wurde eine mehr als 10-fache Erhöhung der Konzentration von HlyA-produzierenden E. coli im entzündlichen Schub einer CU gegenüber Kontrollen verzeichnet. Auch ließen sich Focal Leaks mit HlyA-positiven Signalen darin im Kolon von CU- Patienten im Schub mittels Fluoreszenzmikroskopie nachweisen. EHEC-Typ α-Hämolysin wurde in keinem Biopsat nachgewiesen. In den Kolonisationsversuchen konnte in allen drei Mausmodellen eine HlyA-induzierte Epithelschädigung in Form von Focal Leaks identifiziert werden. Funktionell konnte diesen Läsionen eine Barrierebeeinträchtigung zugeschrieben werden. Pathologisch und klinisch zeigten sich in der Folge erhöhte Entzündungszeichen. In Untersuchungen am epithelialen Zellmodell konnte der HlyA-induzierte Abfall des transepithelialen elektrischen Widerstands am Zellmonolayer nach Gabe von Zinkchlorid nicht mehr beobachtet werden. ZUSAMMENFASSUNG E. coli HlyA verursacht auch im in vivo Modell Barriereschädigungen durch die Bildung von Focal Leaks. Diese Schädigungen können durch vermehrten Antigenübertritt eine intestinale Entzündung begünstigen oder intensivieren. Dies konnte besonders am Entzündungsmausmodell nachvollzogen werden. Im Zusammenhang mit dem vermehrten Vorkommen bei CU- Patienten sollte HlyA als Kofaktor bei der Pathogenese intestinaler Entzündungen in Betracht gezogen werden. Abkürzungen: CED - Chronisch entzündliche Darmerkrankung; CU - Colitis ulcerosa; EHEC – Enterohämorrhagische Escherichia coli; E. coli - Escherichia coli; HDM - Escherichia coli 536 HlyA-defiziente Mutante; HlyA - Escherichia coli α-Hämolysin; PCR – Polymerase Kettenreaktion; qPCR – quantitative real- time PCR; UPEC – Uropathogene Eschrichia coli
INTRODUCTION The influence of a changed intestinal microbiota on inflammatory bowel disease (IBD) has been intensively discussed recently. Both reduced microbial diversity and high concentrations of distinct bacterial phyla are common findings in IBD. Still, the impact of possible colitogenic microbiota remains unknown. Recently, Escherichia coli α-haemolysin (HlyA) was shown to induce focal leaks in colonic cell monolayers. Thus, the aim of the present study was to determine the effect of an infection by HlyA-carrying Escherichia coli (E. coli) in vivo and its possible impact on IBD. METHODS Mucosa- associated, mucus-associated and intraepithelial bacteria from biopsy samples from IBD patients and healthy controls were examined with means of bacterial culture. HlyA-concentrations were assessed culture-independent with quantitative real-time PCR (qPCR). The effect of HlyA-expressing E. coli 536 and its isogenic HlyA-deficient mutant (HDM) on the colon was investigated through colonisation experiments in vivo in three mouse models; wild type, interleukin-10- deficient and monoassociated mice. The effect of the colonisation was measured by clinical, histopathological and electrophysiological assessments. The presence of focal leaks was investigated by confocal laser-scanning microscopy. Furthermore, the inhibitory effects of free zinc ions on HlyA were studied in vitro on colonic HT- 29/B6 cell monolayers. RESULTS Bacterial culture from biopsy specimens showed a tendency towards higher levels of haemolytic bacteria in patients with active ulcerative colitis (UC). Furthermore, there were more intraepithelial bacteria in these patients. In the qPCR measurements UPEC-type HlyA could be found in the majority of the analysed specimens. However, HlyA-levels were more than 10-fold increased in patients with active UC compared to controls. Moreover, focal leaks with HlyA-positive signals inside could be found in the colon of patients with UC. EHEC-Type α-haemolysin could not be found in any specimen. All three mouse models infected with HlyA- producing E. coli showed an increased focal leak area compared to HDM-colonised animals. In functional measurements, barrier breaking properties could be retraced to these lesions. In addition, signs of increased inflammation could be seen both histopathologically and clinically. In the HT-29/B6 measurements a HlyA- related decrease in transepithelial electrical resistance could be abolished by supplementation with zinc chloride. CONCLUSION HlyA impairs the intestinal barrier function through induction of focal leaks and it triggers colitis - particularly in inflammation-prone mice. These focal leaks could increase antigen translocation und thereby could promote or intensify intestinal inflammation. In the context of high HlyA-levels in UC it should be considered as a cofactor for intestinal inflammation. Abbreviations: EHEC- enterohaemorrhagic Escherichia coli; HDM - Escherichia coli 536 HlyA-deficient mutant; HlyA - Escherichia coli α-haemolysin; IBD - inflammatory bowel disease; PCR – Polymerase chain reaction; qPCR – quantitative real-time PCR; UC - ulcerative colitis; UPEC – uropathogenic Escherichia coli
