Der Ostium secundum Defekt (ASD II) gehört zu den häufigsten angeborenen Herzfehlern beim Menschen. Genetische Faktoren scheinen hinsichtlich der Pathogenese struktureller Defekte im Bereich des kardialen Septumapparats eine wesentliche Rolle zu spielen. In dieser Arbeit wurde an einem ausgewählten Patientenkollektiv die Assoziation des ASD II mit Mutationen im Transkriptionsfaktor NKX2.5 und Bone-Morphogenetic-Protein 4 (BMP4) untersucht. In früheren Studien konnten bereits mehrere pathogenetisch relevante Mutationen im NKX2.5-Gen bei Patienten mit isoliertem ASD II bzw. ASD II mit konkomitanten angeborenen Herzfehlern nachgewiesen werden. BMP4 gilt als wichtiger Regulator kritischer Ereignisse der kardialen Morphogenese, welche indirekt die Differenzierung des kardialen Septumapparats wesentlich beeinflussen. Bisher wurden keine Mutationen im BMP4-Gen bei Patienten mit kongenitalen Herzfehlern durch frühere Studien beschrieben. Die Analysen von 170 im Deutschen Herz-zentrum Berlin und in der Franz Volhard Klinik Berlin- Buch gesammelten DNA-Proben von Probanden mit ASD II sowie von 180 Kontrollproben wurden mittels PCR-SSCP und Direktfluoreszenzsequenzierung durchgeführt. Insgesamt konnten keine neuen pathogenetisch relevanten krankheitsassoziierten Mutationen im NKX2.5- und BMP4-Gen identifiziert werden. Im Exon 1 des NKX2.5-Gens wurden im gesamten untersuchten Patientenkollektiv ein bekannter und ein unbekannter Single-Nucleotide- Polymorphism (SNP) ohne Auswirkung auf die Aminosäuresequenz im betreffenden Sequenzabschnitt gefunden. Ein im Exon 5 des BMP4-Gens detektierter SNP wurde im Hinblick auf seine pathogenetische Bedeutung mittels RFLP-Analyse genauer analysiert. Zusätzlich wurden weitere Einflussfaktoren hinsichtlich der molekularen Pathogenese des ASD II nach dem derzeitigen Stand der Literatur diskutiert. Die Sensitivität der für das Mutationsscreening angewendeten SSCP- Analyse wurde im zweiten Teil dieser Arbeit experimentell mit der DHPLC- Methode und der als Goldstandard geltenden Direktsequenzierungs-Methode anhand von 72 durch gerichtete Mutagenese erzeugten Varianten eines Abschnitts des humanen Faktor V-Gens verglichen. Die DNA-Konzentration der jeweiligen Plasmid-Probe wurde hierzu vor den eigentlichen Analysen zur Schaffung eines im Vergleich zu genomischer DNA äquimolaren Massenverhältnisses unter Anwendung der qRT-PCR entsprechend modifiziert. In dieser Arbeit erwies sich die DHPLC-Methode hinsichtlich der Sensitivität, des technischen Aufwands und des experimentellen Handlings der SSCP-Methode überlegen. In der Diskussion wurden neben der Auswertung der durch Direktsequenzierung erhaltenen Ergebnisse aus perspektivischer Sicht die Möglichkeiten der Next Generation Sequencing (NGS)-Technologie erörtert.
The ostium secundum atrial septal defect (ASD II) is one of the most frequent congenital heart diseases in human. Though the etiology of congenital heart disease is largely unknown, genetic factors seem to be play an essential role with regard to the morphogenesis and to structural defects of the atrial septum. In this work the association of the ASDII with mutations in the transcription factor NKX2.5 and the bone morphogenetic protein 4 (BMP4) was examined. Earlier studies already identified pathogenetic mutations in the NKX2.5 gene in a variety of congenital heart diseases especially atrial septal defect, ventricular septal defect and tetralogy of fallot. BMP4 is presumed to be an important regulator of critical events in cardiogenesis, which indirectly influence the differentiation of the cardiac septal system. Up to date there is no study, which examined the association of mutations in the human BMP4 gene in patients with congenital heart diseases. In this work the coding regions of both genes were analysed in 170 patients with ostium secundum atrial septal defect (ASDII) by PCR - single strand conformation polymorphism analysis (PCR-SSCP) and sequencing. In total 4 genetic variations were detected and discussed with respect to their pathogenetic relevance. In addition, other influencing factors were discussed with regard to the molecular pathogenesis of the ASD II according to the present state of the literature. In the second part the PCR-SSCP-analysis, which was used for mutational screening in the NKX2.5 and BMP4 genes, has been evaluated experimentally in comparison to DHPLC analysis and direct-sequencing, which is considered the gold standard, with regard to the sensitivity. 72 artificial mutations in a selective part of the human factor V gene were generated by using PCR-site, directed mutagenesis. After constructing an equimolar mass ratio of genomic DNA and plasmid DNA, which was verified by quantitative real time pcr analysis, all samples were analysed by PCR-SSCP, DHPLC and direct- sequencing. Different aspects of all used methods and also the potential of next generation sequencing were discussed.
