Oilseed rape (Brassica napus L.) is an important crop plant primarily grown for oil production. Despite its high nitrogen (N) uptake, the overall nitrogen use efficiency (NUE) of oilseed rape is rather low. To achieve optimal oilseed yields, high amounts of N fertilizer must be applied to the field which is economically adverse and has negative environmental effects. The major fraction of N that the plant requires for pod development derives from remobilization of N which has accumulated during the vegetative phase in the stem and in leaves. One critical factor determining the NUE is the timing of leaf senescence initiation and the efficiency of N remobilization to the sink organs. At the time of abscission, the lower oilseed rape leaves still have a high N content, resulting in a return to the soil during winter of up to 100 kg N ha-1 of the approximately 200 kg fertilizer N ha-1 required for optimal seed yield. Nitrogen remobilization is significantly more efficient in younger leaves in the upper canopy that senesce during pod development. At the time of abscission their nitrogen content is only 1% of dry weight. The aims of this work were (1) to advance the understanding of N-remobilization and -allocation under normal and limiting N supply, (2) to identify sensitive early expression markers for monitoring the N status of oilseed rape plants, and (3) to investigate the consequences of future atmospheric conditions with elevated CO2 concentrations on oilseed rape gene expression at varying N supply. 1) Leaf transcriptome analyses under adequate and limited N supply during development. Old source leaves (leaf #4) and young sink leaves (leaf #8) of oilseed rape spring variety 'Mozart' plants grown under normal (150 kg N ha-1) and limiting N conditions (75 kg N ha-1) were harvested at 4 different developmental stages (78, 85, 92 and 99 days after sowing, DAS). Labeled cRNA of the samples was hybridized to a newly developed custom B. napus microarray carrying 59,577 oligonucleotide probes from B. napus EST contigs. To annotate them, a BLAST search against the Arabidopsis thaliana genome sequence (TAIR version 10) was performed and the (putative) gene function of the most closely related Arabidopsis ortholog was assigned to the B. napus EST contigs. Microarray data revealed that under low N condition most of gene expression changes occur at earlier time points (between 85 and 92 DAS) when compared with normal N supply. Most of the regulated genes were senescence-associated transcription factors or related to senescence-associated activities, such as up-regulation of protein degradation. This indicates that low N promotes earlier senescence initiation in old oilseed rape leaves. Furthermore, the transcriptome response of young leaves to different N conditions was opposite to that of old leaves. In young leaves (#8) under normal N more senescence associated transcriptome alterations were observed, indicating a delayed senescence in sink leaves under N limitation which can be correlated with a more economic use of available resources under N limitation. 2) Identification of expression markers for the plant N status. Using two independent microarray studies on oilseed rape spring variety Mozart (growth chamber condition) and winter varieties Apex and Capitol (hydroponic condition) grown under sufficient and limited N supply, 46 potential markers were selected. 35 of these potential markers were identified in Mozart based on their high expression changes (>10 fold) between different N conditions. In addition 12 potential markers which were identified by our collaborators (Prof. Horst, Leibnitz-University of Hannover) as N-sensitive and cultivar-specific (Apex and Capitol cultivars) were included. Between these two set of genes, one potential marker was shared. The expression of all 46 potential marker genes was further analyzed by qPCR in the five winter cultivars NPZ2, NPZ5, NPZ1005 and MSL101B, grown under greenhouse condition and Major, grown under field condition to identify the most reliable markers. Eventually, 13 markers showing distinct expression levels dependent on N supply but independent of cultivar and growth condition were identified. 3) Leaf transcriptome response of oilseed rape plants to elevated CO2 levels under different N conditions. Oilseed rape plants (cv. Mozart) were grown in growth chamber under ambient (380 ppm) or elevated (550 ppm) atmospheric CO2 levels in combination with normal or low N conditions. By using the same B. napus microarray as in 1), transcriptome responses of both old leaf (#4) and young leaf (#8) were analyzed at 92 DAS under normal and low N conditions. The most striking observation under elevated CO2 (in young and old leaves under both N conditions) was up-regulation of the genes belonging to C-associated pathways such as photosynthesis, cell wall (synthesis and degradation) lipid metabolism and biosynthesis of C-containing secondary metabolites. The coordinated regulation of these pathways correlates with and might explain the phenotypic alterations of oilseed rape plants grown at high CO2 levels, namely higher vegetative growth and biomass production, as was reported by our collaborator (Franzaring et al. 2011).
Raps (Brassica napus L.) stellt eine wichtige Nutzpflanze, die hauptsächlich zur Produktion von Öl verwendet wird, dar. Trotz der effizienten Stickstoffaufnahme ist die Effizienz der Stickstoffnutzung (Nitrogen Use Efficiency, NUE) von Raps eher gering. Um dennoch eine optimale Samenausbeute für die Gewinnung von Öl zu erhalten, müssen große Mengen an Stickstoffdünger auf den Feldern für den Rapsanbau ausgebracht werden, was zu wirtschaftlichen Nachteilen und negativen Effekten für die Umwelt führt. Der Großteil des für die Entwicklung der Schoten benötigten Stickstoffs (N), wird durch die Remobilisierung von, sich während der vegetativen Phase, im Stamm und in den Blättern akkumulierten Stickstoff gewonnen. Ein kritischer Faktor, um die NUE zu bestimmen, ist der Zeitpunkt der Initiierung der Blattseneszenz und die Effektivität der Remobilisierung von Stickstoff zu den verbrauchenden Organen (Stickstoffsenken) in der Pflanze. Zum Zeitpunkt der Abszission haben die niedriger gelegenen Blätter weiterhin einen hohen Stickstoffgehalt. Dies führt während des Winters zu einer Rückzufuhr in den Boden von bis zu 100 kg Stickstoff ha-1 der schätzungsweise 200 kg an benötigtem Stickstoffdünger, die für eine optimale Samenausbeute benötigt werden. Die Remobilisierung von Stickstoff ist in den jüngeren Blättern des oberen Teils der Pflanze, die während der Schotenentwicklung seneszieren, wesentlich effizienter. Zum Zeitpunkt der Abszission macht ihr Stickstoffgehalt lediglich 1 % der Trockenmasse aus. Die Ziele dieser Arbeit waren (1) das Verständnis zur Remobilisierung und Verteilung von Stickstoff in Raps unter normaler und limitierter Stickstoffversorgung zu verbessern, (2) die Identifizierung von Markergenen, die während der Frühphase der Seneszenz exprimiert werden, um den Stickstoffstatus von Rapspflanzen zu überwachen, und (3) die Untersuchung der Auswirkungen von zukünftigen atmosphärischen Bedingungen mit erhöhten CO2-Konzentrationen auf die Genexpression von Rapspflanzen unter variierendem Stickstoffangebot. 1) Transkriptomanalysen in Blättern unter günstigem und limitierendem Stickstoffangebot während der Entwicklung der Pflanze. Alte Source-Blätter (Blatt #4) und junge sink-Blätter (Blatt #8) von Rapspflanzen der Sommervarietät „Mozart“, die unter normalem (150 kg N ha-1) und limitierendem Stickstoffangebot (75 kg N ha-1) wuchsen, wurden zu 4 unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten (78, 85, 92 und 99 Tage nach der Aussaat, Days After Sowing, DAS) geerntet. Markierte cRNA der Proben wurde gegen 59.577 Oligonukleotid-Sonden eines neu erstellten Microarrays hybridisiert. Die Oligonukleotid-Sonden wurden aus B. napus EST-Contigs erstellt. Um sie zu annotieren, wurde ein BLAST-Suchlauf gegen die Arabidopsis thaliana Genomsequenz (TAIR Version 10) durchgeführt und die (putative) Genfunktion des nächst-verwandten Arabidopsis-Orthologs den B. napus EST- Contigs zugeordnet. Der Vergleich der Microarray-Daten zwischen dem normalen und niedrigen Stickstoffangebot zeigte, dass die meisten Veränderungen der Genexpression bei einem niedrigen Stickstoffangebot zu frühen Zeitpunkten (zwischen 85 und 92 DAS) auftraten. Die meisten der regulierten Gene waren Seneszenz-assoziierte Transkriptionsfaktoren oder standen in Verbindung zu Seneszenz-assoziierten Prozessen, wie z.B. der Hochregulierung der Proteindegradierung. Dies weist darauf hin, dass ein niedriges Stickstoffangebot zu einer früheren Initiierung der Seneszenz in Blättern von Rapspflanzen führt. Weiterhin waren Veränderungen im Transkriptom als Antwort auf verschiedene Stickstoffbedingungen in jungen Blättern gegensätzlich zu denen in älteren Blättern. In jungen Blättern (#8) wurden unter normalen Stickstoffbedingungen mehr Seneszenz-assoziierte Veränderungen des Transkriptoms beobachtet, was auf eine verzögerte Seneszenz in Sink-Blättern unter Stickstofflimitierung hinweist. Dies kann möglicherweise auf einen ökonomischeren Verbrauch von verfügbaren Ressourcen unter Stickstoffmangel zurückgeführt werden. 2) Identifizierung von Expressionsmarkern für den Stickstoffstatus in Rapspflanzen. Basierend auf zwei unabhängigen Microarray- Studien zu der Sommerraps-Varietät Mozart (Anzucht in der Klimakammer) und den Winterraps-Varietäten Apex und Capitol (Anzucht in hydroponischen Systemen), die unter ausreichender und limitierender Stickstoffversorgung wuchsen, wurden 46 potenzielle Marker ausgewählt. 35 dieser potenziellen Marker wurden in Mozart, basierend auf hohen Expressionsänderungen (>10-fach) bei verschiedenen Stickstoffangeboten, identifiziert. Weitere 12 potenzielle Marker, die zuvor durch unseren Kooperationspartner (Prof. Horst, Leibnitz-Universität Hannover) in Apex und Capitol identifiziert wurden, vervollständigten die Auswahl. Für alle potenziellen Marker wurde gezeigt, dass sie sensibel gegenüber dem Stickstoffangebot und Varietätsspezifisch sind. Einer der potenziellen Marker kam in beiden Auswahlen von Genen vor. Um die zuverlässigsten und robustesten Marker zu identifizieren, wurde die Expression aller 46 potenziellen Markergene in 5 verschiedenen Wintervarietäten (NPZ2, NPZ5, NPZ1005 und MSL101B, angezogen unter Gewächshaus- und Major, angezogen unter Feldbedingungen) per qPCR analysiert. Letztendlich wurden 13 Marker identifiziert, die deutliche Expressionsänderungen abhängig vom Stickstoffangebot aber unabhängig von Rapsvarietät und Wachstumsbedingungen zeigen. 3) Veränderungen des Blatttranskriptoms von Rapspflanzen bei erhöhtem CO2-Gehalt und unterschiedlichen Stickstoffkonzentrationen. Rapspflanzen der Varietät „Mozart“ wurden in Klimakammern unter atmosphärischem (380 ppm) oder erhöhtem (550 ppm) CO2-Gehalt in Kombination mit normalen oder niedrigen Stickstoffkonzentrationen angezogen. Unter Verwendung des gleichen B. napus Microarray-Setups wie in 1), wurden Expressionsänderungen in Blatt #4 und Blatt #8 (altes bzw. junges Blatt) nach 92 DAS untersucht. Das auffälligste Ergebnis bei erhöhtem CO2 Gehalt (in jungen und alten Blättern) war die Hochregulierung der Expression von Genen, die an C-assoziierten Prozessen wie Photosynthese, Zellwandsynthese und -abbau, Lipidmetabolismus und Biosynthese von C-enthaltenden sekundären Metaboliten beteiligt sind. Die koordinierte Regulierung dieser Prozesse korreliert mit phänotypischen Änderungen, wie verstärktes vegetatives Wachstum und erhöhte Biomasse der Rapspflanzen (Franzaring et al. 2011), die unter einem erhöhten CO2-Gehalt wuchsen und kann diese möglicherweise erklären.
