Der größte Teil der heutigen Arzneimittel stammt direkt oder indirekt von Biomolekülen ab. Sie dienen als Leitstrukturen und werden weiter chemisch verändert, um ihre erwünschten Eigenschaften zu optimieren und ihre Nebenwirkungen zu minimieren. Auf der Suche nach einem Arzneimittel gegen chronisch entzündliche und Autoimmunerkrankungen konnte 1992 eine Leitstruktur identifiziert werden, welche einen inhibitorischen Effekt auf die Expression von ICAM-1 zeigte. Bei dieser Substanz handelte es sich um Hun-7293, ein sekundärmetabolitisch in Pilzen gebildetes makrozyklisches Heptadepsipeptid. Eine erste Optimierung dieser Substanz führte zum Derivat Cotransin. Bis heute ist die Cotransin-Wirkung noch nicht im Detail geklärt. Es ist jedoch bekannt, dass es die Expression einiger sekretorischer und Membranproteine inhibiert. Es wird vermutet, dass Cotransin Signalsequenz-spezifisch die stabile Insertion der naszierenden Polypeptidkette in den Sec61-Translokationskanal des endoplasmatischen Retikulums inhibiert. Als Cotransin-sensitiv wurden vor dieser Arbeit nur fünf Proteine beschrieben, die Membranrezeptoren VCAM1, P-Selektin und CRF1R und die sekretorischen Proteine β-Lactamase und Angiotensinogen. Aufgrund ihrer zentralen Rolle in der Pharmakologie wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Cotransin-Sensitivität einiger ausgewählter G -Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCR) untersucht. Von den zehn untersuchten GPCR wurde die Expression des TSHR, des ETAR und des ETBR durch Cotransin inhibiert. Bei der Erstellung von Konzentrationswirkungskurven zeigte sich, dass der inhibitorische Effekt von Cotransin bei höheren Konzentrationen abgeschwächt ist, was vermutlich auf Löslichkeitsprobleme und einer daraus resultierenden Präzipitation der Substanz zurückzuführen ist. Darüber hinaus konnte im Falle des ETBR gezeigt werden, dass durch die Cotransin-Behandlung der Zellen die Expression des Rezeptors vollständig unterbunden wird. Dafür wurde mit Hilfe von Kaede-Fusionsproteinen eine neue Methode etabliert, mit der die Expression von Rezeptoren und damit die Cotransin-Wirkung in Echtzeit messbar ist – sowohl mikroskopisch, auf Einzelzellebene, als auch durchflusszytometrisch innerhalb einer großen Zellpopulation. Es konnte ferner gezeigt werden, dass das Signalpeptid (SP) des ETBR für die Cotransin- Sensitivität verantwortlich ist, und dass diese Eigenschaft durch Fusion des ETBR-SP auf andere Cotransin-insensitive GPCR übertragbar ist. Um weitere Cotransin-sensitive Proteine zu identifizieren wurde eine massenspektrometrische Expressionsanalyse von Proteinen nach Cotransin- Behandlung von Zellen durchgeführt. Dabei wurden deutlich mehr Cotransin- sensitive Proteine gefunden als erwartet, wobei ein Teil von ihnen eine Signalankersequenz (SAS) besitzt. Die Cotransin-Sensitivität kann somit offensichtlich sowohl durch SP als auch durch SAS vermittelt werden. Peptide, welche spezifisch die Biosynthese einzelner Proteine hemmen, wären wertvolle zellbiologische Werkzeuge und würden die Möglichkeit eröffnen, mit völlig neuartig wirkenden Substanzen in Signaltransduktionswege eingreifen zu können. Aus diesem Grund wurden im letzten Teil der Arbeit neue Cotransin-Derivate hergestellt, mit dem Ziel, Wirkstärke und Selektivität der Substanz zu verändern. Im Rahmen dieser Versuche ist es bisher nicht gelungen, die Spezifität von Cotransin zu verändern oder die Wirkstärke zu verbessern. Die Arbeiten liefern einen Beitrag zu ersten Struktur- / Funktionsanalysen des Cotransins. So zeigte sich, dass die zyklische Struktur des Heptadepsipeptids für die Wirkung essentiell ist. Ferner konnte gezeigt werden, dass der Austausch der Position 6 im Amid keinen weiteren Einfluss auf die Wirksamkeit gegenüber dem Amid hat. Zusammengefasst wird in dieser Arbeit belegt, dass Cotransin keinesfalls so selektiv ist, wie von Garrison et al. publiziert. Es wird ferner klar, dass es schwierig ist, die Struktur- / Funktionsbeziehung des Cotransins zu charakterisieren, um selektive Derivate zu finden. Da es sich bei den Zyklodepsipeptiden um völlig neue Wirkstoffe mit hohem Potential handelt, sollten diese Arbeiten fortgeführt werden.
The majority of drugs today come directly or indirectly from biomolecules. They are used as lead compounds and are further chemically modified to optimize the required properties and minimize their side effects. In search of a drug against chronic inflammatory and autoimmune diseases, a lead structure was identified in 1992, which shows an inhibitory effect on the expression of ICAM-1. This substance was Hun-7293, a macrocyclic heptadepsipeptide which is a secondary metabolite in fungi. A first optimization of this substance led to the derivate cotransin. Until today, the cotransin-effect has not yet been clarified in detail. However, it is known that the expression of some secretory and membrane proteins is inhibited. It is assumed that cotransin inhibits the stable insertion of the nascent polypeptide chain into the Sec61 translocation channel of the endoplasmatic reticulum in a signal sequence discriminative manner. Previous to this work only five cotransin-sensitive proteins were described – the membrane receptors VCAM1, P-selectin and CRF1R and the secretory proteins β-lactamase and angiotensinogen. As g-protein- coupled receptors (GPCRs) play a central role in pharmacology, in the first part of this work, the cotransin-sensitivity of some selected GPCRs was examined. Ten GPCRs were analysed and the expression of the TSHR, the ETAR and ETBR was inhibited by cotransin. The concentration response curves showed that the inhibitory effect of cotransin is weakened at higher concentrations, presumably due to solubility problems and resultant precipitation of the substance. Furthermore, in case of the ETBR, it was shown that due to the cotransin treatment the expression is completely inhibited. Additionally, using Kaede fusion proteins we developed a new method to measure the expression of receptors in real time and thus the cotransin-effect – both microscopically at single cell level and by flow cytometry within a big cell population. It could be shown that the signalpeptide (SP) of the ETBR is responsible for the cotransin-sensitivity and that this property can be transferred by fusion of the SP-ETBR to other cotransin-insensitive GPCRs. To identify other cotransin-sensitive proteins a mass spectrometric analysis of protein expression after cotransin-treatment was carried out. There was a notably increased amount of cotransin-sensitive proteins than expected and part of them possess a signalanchorsequence (SAS). The cotransin-sensitivity can thus be mediated by both SPs and SASs obviously. Peptides that specifically inhibit the biosynthesis of individual proteins would be valuable cellbiological tools and would open the possibility of completely new active substances in signal transduction. Therefore in the last part of this thesis new cotransin derivatives were synthesized, with the aim to change the potency and selectivity of the substance. During the trials it has not yet been possible to alter the specificity of cotransin or modulate the potency in the desired direction. This work contributes to a first structure / function- analysis of cotransin, showing that the cyclic structure is essential for the effect of heptadepsipeptids. Furthermore, it was shown that the exchange of position 6 in the amide has no further influence on the effectiveness compared to the amide. In summary, this work shows that cotransin is not as selective as Garrison et al. published. It was also shown that it is difficult to assess the structure / function-relationships that characterize cotransin to find more selective derivatives. The cyclodepsipeptides are completely new agents with high potential, therefore the research work should be continued.
