The Role of Transcription Factors Klf4 and Icsbp in the Development of Myeloid Cells

Abstract

Icsbp deletion leads to changed differentiation program of myeloid progenitors reflected in high production of granulocytes and low production of macrophages. In order to study the underlying mechanism of this switch, the gene expression profiles of isolated granulocyte-macrophage progenitors (GMP) from Icsbp+/+ and Icsbp-/- mice were compared, revealing deregulation of other hematopoietic transcription factors. The goal of this work was to investigate the contribution of one of these additional deregulations to the observed Icsbp-/- mouse phenotype, namely the down-regulation of the transcription factor Klf4. The experiments described in this work identify Klf4 as a factor which has a strong influence on myeloid progenitors, directing them to differentiate along the macrophage lineage, as shown by significantly higher percentage of macrophage colonies developing from Klf4-ERT2 over-expressing myeloid progenitors. Klf4-ERT2 led to the macrophage maturation even when the progenitors were cultured with granulocyte-colony stimulating factor (G- CSF) or when expressed in the Icsbp-/- cells (which have propensity to form granulocytes), suggesting the ability of Klf4 to override granulocyte- promoting effects of both extracellular and intracellular signals and reprogram the cell fate to the macrophage lineage. Up-regulation of several putative macrophage genes and down-regulation of genes involved in granulocyte proliferation suggested that Klf4 exerts it macrophage promoting effect by coordinating molecular changes which precede the commitment to this lineage. Another feature of the Klf4-ERT2 over-expression is its strong cytostatic effect on developing myeloid cells, suggesting that Klf4 acts as a proliferation/differentiation switch in the myeloid development. p21Waf1 is Klf4 transcriptional targets whose contribution to the Klf4 effects on myeloid cells was analyzed by over-expressing p21Waf1 in Klf4+/+ and Klf4-/- myeloid progenitors. In addition to the full-length p21Waf1 over-expression, the compartmentalized p21Waf1 expression was simulated by the ability of the p21-ERT2 fusion construct to translocate in the nucleus in the presence of the ERT2-ligand or to stay sequestered in the cytosol in the ligand absence. Enhanced macrophage formation was observed in all cases of forced p21Waf1 expression, suggesting that p21Waf1 itself enhances macrophage maturation. Since the reduction in the colony formation was observed only when p21Waf1 was allowed to enter the nucleus, we conclude that the roles of p21Waf1 in differentiation and cell cycle control can be decoupled and depend on the subcellular localization of p21Waf1. Another aspect of myelopoiesis, development of eosinophilic granulocytes, was analyzed. The gene profiling of Icsbp+/+ and Icsbp-/- GMPs identified strong down-regulation of several eosinophil-specific genes in the absence of Icsbp, suggesting perturbed eosinophilopoiesis. We confirmed that Icsbp-/- eosinophil progenitors are reduced in number and have aberrant differentiation profile. This defective eosinophil proliferation is based on reduced expression of the main eosinophil growth factor receptor, Il-5Rα and reduced expression of an important eosinophil intrinsic factor, Gata1. Summarized, this work identifies Klf4 as novel macrophage maturation promoting factor, whose effects in myelopoiesis are partially mediated by its downstream target p21Waf. Additionally, this work revealed previously undetected myeloipoietic defect in Icsbp-/- mice, namely perturbed development of eosinophils, identifying thereby Icsbp as an important factor in eosinophilopoiesis.

Der Icsbp Knockout veraendert das Differenzierungsprogramm myeloider Progenitoren, was sich in einer erhoehten Produktion von Granulozyten und einer erniedrigten Produktion von Makrophagen manifestiert. Um den zugrunde liegenden Mechanismen fuer diese Veraenderung auf die Spur zu kommen, wurden Granulozyten-Makrophagen-Vorlaeuferzellen (GMP) aus Icsbp+/+ und Icsbp-/- Maeusen isoliert und ihre Expressionsmuster verglichen. Diese Analyse offenbarte eine Deregulierung mehrerer haematopoietischer Transkriptionsfaktoren. Ziel dieser Arbeit war es, den Beitrag einer dieser zusaetzlichen Deregulierungen zum Icsbp-/- Phaenotyp zu untersuchen, der Herabregulierung des Klf4 Transkriptionsfaktors. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass Klf4 die Entwicklung myeloider Progenitoren erheblich beeinflusst, indem er die Differenzierung entlang der Makrophagenlinie steuert, was sich anhand der signifikant erhoehten Prozentsaetze von Makrophagenkolonien erkennen laesst, die sich aus Klf4-ERT2 ueberexprimierenden myeloiden Progenitoren entwickeln. Klf4-ERT2 ueberexpression fuehrt sogar zu vermehrter Makrophagenreifung, wenn die Kolonien in G-SCF kultiviert werden oder wenn Klf4-ERT2 in Icsbp-/- Zellen (die eine verstaerkte Neigung haben, Granulozyten zu bilden) exprimiert wird. Durch die Klf4 Ueberexpression koennen also offenbar sowohl extrazellulaere als auch intrazellulaere Granulozyten-foerdernde Faktoren uebergangen werden und die Entwicklung der Zellen in Richtung Makrophagen gesteuert werden. Die Heraufregulierung mehrerer mutmasslich Makrophagen-spezifischer Gene und die Herabregulierung von Genen, die in die Granulozytenentwicklung involviert sind deuten darauf hin, dass Klf4 seinen Makrophagen-foerdernden Effekt durch die Koordinierung molekularer Veraenderungen ausuebt, die der Festlegung auf diese Linie vorausgehen. Ein weiteres Merkmal der Klf4 Ueberexpression besteht in einem starken zytostatischen Effekt auf die sich entwickelnden myeloiden Zellen, was deutet auf eine Funktion von Klf4 als Proliferations/Differenzierungsschalter in der myeloiden Entwicklung hin. p21Waf1 ist eines der durch Klf4 regulierten Gene, dessen Beitrag zu den bei Klf4 verursachten Veraenderungen bei der Entwicklung myeloider Progenitoren, durch p21Waf1 Uberexprimierung in Klf4+/+ und Klf4-/- myeloiden Progenitoren analysiert wurde. Zudem wurde die kompartimentalisierte Ueberexpression von p21Waf1 getestet, indem ein p21- ERT2 Konstrukt durch Zugabe des ERT2-Liganden dazu gebracht wurde, in den Zellkern zu wandern, waehrend es ohne Ligand im Cytosol verblieb. Sowohl bei cytosolischer, als auch bei nukleaerer Ueberexpression von p21Waf1 kam es zu einer verstaerkten Bildung von Makrophagen. Dies deutet darauf hin, dass p21Waf1 fuer den Phaenotyp der Klf4 Ueberexprimierenden Zellen verantwortlich ist. Da der zytostatische Effekt nur dann beobachtet wurde, wenn p21Waf1 in den Zellkern translozieren konnte, koennen wir feststellen, dass die Rollen von p21Waf1 bei Zelldifferenzierung und Zellwachstum unabhaengig voneinander sind und haengen von der subzellulären Lokalisierung des Faktors ab. Neben der Analyse der Faktoren, die die Entwicklung von Makrophagen und neutrophiler Granulozyten steuern, wurde noch ein anderer Aspekt der Myelopoiese untersucht: die Entwicklung eosinophiler Granulozyten. Der Vergleich der Expressionsmuster der Icsbp+/+ und Icsbp-/- GMP ergab eine starke Herabregulierung mehrerer eosinophil- spezifischer Gene, was eine gestoerte Eosiniphilopoiese in Icsbp-/- Maeusen vermuten liess. Tatsaechlich konnte eine reduzierte Zahl und gestoerte Diferenzierungs Potenzial von eosinophilen Progenitoren in Icsbp-/- Maeusen beobachtet werden. Die defekte Proliferation der Icsbp-/- Eosinophilen laesst sich auf eine verminderte Expression des wichtigsten Eosinophilen- Wachstumsfaktors, Il5-R(Alpha) und eines wichtigen intrinsischen Faktors, Gata1 zurueckfuehren. Durch diese Arbeit konnte Klf4 als ein neuer Makroplagen-Reifungs- Faktor identifiziert werden, dessen Effekte auf die Myelopoiese zumindest teilweise durch sein Zielgen p21Waf1 ausgeuebt werden. Zudem wurde in dieser Arbeit als ein bisher unbekannter myelopoietischer Defekt die gestoerte Entwicklung in Icsbp-/- Maeusen entdeckt, wodurch Icsbp als ein wichtiger Faktor in der Eosinophilopoiese identifiziert wurde.