dc.contributor.author
Dassler, Katrin
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:48:09Z
dc.date.available
2005-10-18T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8448
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12647
dc.description
Titelblatt, Inhalt, Abkürzungsverzeichnis
1\. Einleitung 1
2\. Material und Methoden 16
3\. Ergebnisse 36
4\. Diskussion 66
5\. Zusammenfassung und Summary 83
6\. Literaturverzeichnis 87
7\. Anhang 95
Danksagung
Lebenslauf
dc.description.abstract
Der Transferrinrezeptor (TfR) ist ein Zelloberflächenprotein, das die
zelluläre Eisenaufnahme durch Transferrin vermittelt. Im Blut findet sich eine
lösliche Form des Rezeptors (sTfR), die durch proteolytische Spaltung des
membrangebundenen Proteins C-terminal von R100 im stalk-Bereich zwischen
Ectodomäne und Transmembranbereich freigesetzt wird. Der als Shedding
bezeichnete Freisetzungsprozess wird in HL60-Zellen durch eine Metalloprotease
vermittelt, die sensitiv gegenüber dem Tumornekrosefaktor ?-Proteaseinhibitor
TAPI2 reagiert und sehr wahrscheinlich zur Proteasefamilie der ADAMs zu zählen
ist. Der sTfR dient als Marker für Eisenstatus und erythropoetische Aktivität.
Es wird diskutiert, dass er als erythroider Regulator des systemischen
Eisenstoffwechsels fungiert. In dieser Arbeit wurde untersucht, wie die
Freisetzung auf molekularer Ebene vor allem bezüglich des Eisenstatus
gesteuert und reguliert wird. Dadurch konnten neue Kenntnisse zur Funktion des
sTfR erlangt werden. Zur Untersuchung des Sheddingprozesses wurden
verschiedene Zelllinien auf ihre sTfRFreisetzungsaktivität hin überprüft.
Dabei konnte erstmals gezeigt werden, dass nicht nur Blutzellen in der Lage
sind, ihren TfR freizusetzen, sondern auch Zellen aus solidem Gewebeverbund.
Dies legt nahe, dass das TfR-Shedding ein ubiquitärer Prozess aller TfR
tragenden Zellen ist. Des Weiteren konnte auf mechanistischer Ebene
nachgewiesen werden, dass zunächst innerhalb des TfR-Dimers die Ectodomäne
einer TfR-Kette und anschließend die der anderen proteolytisch abgespalten
wird. Durch die Herstellung von TfR-Sheddingreporterenzymen wurde gezeigt,
dass für die Freisetzung des sTfR eine korrekt glycosylierte, membranständige
Form von essentieller Bedeutung ist, denn nur vollständig glycosylierte
Rezeptoren gelangen an die Zelloberfläche und werden gesheddet. Der Anteil an
freigesetztem TfR und seine Größe unterscheiden sich je nach Zelltyp, was auf
eine Regulation des Sheddingprozesses hindeutet. Neben einem Hauptfragment mit
einer Größe von etwa 80 kD wird von vielen Zellen durch alternative Spaltung
eine kleinere Nebenform mit einer Größe von 76 kD freigesetzt. Zur Analyse
dieser unterschiedlichen TfR-Spaltstellen wurden Mutationen in den TfR-stalk
eingefügt. Die vorgenommenen Aminosäureaustausche um die Hauptspaltstelle des
TfR (R100G, R100E, L101G, L101D) führen zu einer Inhibition der Proteolyse und
weisen damit auf die Spezifität des Proteolyseprozesses hin. Es konnte
weiterhin gezeigt werden, dass die Inhibition an der Hauptspaltstelle durch
alternatives Shedding kompensiert wird. Inhibitionsanalysen der stalk-Mutanten
zeigen, dass an der Freisetzung des sTfR zwei membranständige Proteasen
beteiligt sind, die sich durch allgemeine Metalloproteaseinhibitoren
inhibieren lassen, jedoch unterschiedliche Sensitivität gegenüber
spezifischeren Inhibitoren für die verschieden Metalloproteaseklassen
aufweisen. Das Inhibitorprofil deutet daraufhin, dass sowohl die Freisetzung
der Hauptform des sTfR als auch die der alternativen Form durch ADAM-Proteasen
vermittelt wird. Der gesamte Austausch des TfR-stalk gegen den von
Interleukin6-Rezeptor und den des proTumornekrosefaktor ? bewirken keine
Inhibition des Sheddings. Alle Ergebnisse zusammen zeigen, dass die
Aminosäuren um die Spaltstelle die sTfR-Freisetzung stark beeinflussen, aber
auch die dreidimensionale Struktur des stalk von entscheidender Bedeutung für
das Shedding ist. Die Struktur des TfR-stalk stellt eine für die
Proteaseerkennung wichtige, statische Eigenschaft dar. In dieser Arbeit konnte
zusätzlich gezeigt werden, dass ein Transportmolekül des Eisenstoffwechsels,
das ferri-Transferrin (ferri-Tf), diesen Prozess beeinflusst. In HL60- und
TRVb-Zellen wird durch steigende Konzentrationen an ferri-Tf die sTfR-
Freisetzung inhibiert, unabhängig von der zellulären TfR-Expression. Die
Analyse von Zellen, die TfRMoleküle mit unterschiedlicher Affinität zu ferri-
Tf exprimieren, erbrachte einen direkten Zusammenhang des Inhibitionseffekts
mit der Bindung von ferri-Tf an den TfR. Der gleiche Effekt konnte auch in
gereinigten Membranen nachgewiesen werden. Der Inhibitionsmechanimus muss
demnach auf einer signalwegunabhängigen, kompetitiven Wirkung des ferri-Tf
beruhen. Aufgrund der bekannten Kristallstruktur des ferri-Tf:TfR-Komplexes
ist zu vermuten, dass durch die Bindung von ferri-Tf die Wechselwirkung der
Protease mit dem stalk-Bereich unterbunden wird. Aus den gewonnenen
Erkenntnissen wurde ein Modell entwickelt, nach dem die Freisetzung des sTfR
sowohl vom zellulären Eisenbedarf als auch von der systemischen
Eisenverfügbarkeit gesteuert wird. Der freigesetzte sTfR wird nach diesem
Modell im Blut durch ferri-Tf gepuffert, so dass lokale Effekte den
Stoffwechsel nur dann beeinflussen, wenn sie das systemische Gleichgewicht
verändern. Die Untersuchungen dieser Arbeit geben deshalb neue Erkenntnisse
zur Funktion des sTfR und zeigen erstmals wie seine Freisetzung reguliert
wird.
de
dc.description.abstract
The transferrin receptor (TfR) is a cell surface protein that mediates
cellular iron uptake by ferri-transferrin (ferri-Tf). A soluble form of the
receptor is found in the bloodstream. It is generated by proteolytic cleavage
of cellular TfR C-terminal of R100 within the juxtamembrane region of the
ectodomain. In HL60 cells this shedding process is mediated by a
metalloprotease of the ADAM-family sensitive to the tumour necrosis factor ?
protease inhibitor TAPI2. The sTfR is used as diagnostic marker for iron
demand and erythropoetic activity and furthermore is postulated as erythroid
regulator of systemic iron metabolism. In this study the regulation mechanism
of sTfR release is examined and new knowledge attained for the function of the
sTfR. To examine the shedding process different cell lines were analysed for
TfR-release activity. For the first time it is shown that not only blood cells
but also tissue cells are able to shed sTfR from the cell surface, indicating
that TfR-shedding is a general process of all TfR expressing cells. The
release occurs by sequential proteolytic cleavage of the two TfRectodomains in
each TfR-dimer. A prerequisite for shedding is a proper glycosylation of the
TfR as shown by TfR-shedding reporter enzymes. Besides cleavage at the major
cleavage site many cell lines generate a 4 kD smaller, alternative shedding
product of the TfR. The different cleavage sites were analysed by mutation
studies within the TfR stalk region. Point mutations around the major cleavage
site results in an inhibition of shedding indicating the specificity of the
proteolytic process. The inhibition of the cleavage at the major site is
compensated by enhanced alternative shedding. Inhibitor studies reveal that
two different metalloproteases of the ADAM family are involved in TfR release.
Replacing the TfR-stalk with the corresponding sequences from pro tumour
necrosis factor ? and interleukin 6 does not inhibit sTfR release. In
conclusion all results show that (I) the amino acids around the cleavage site
have an influence on TfR-shedding and (II) the three dimensional structure of
the stalk is relevant for the cleavage. The structure of the TfR-stalk is an
important, determinate attribute for protease recognition. In this study it is
shown additionally that a transport molecule of iron metabolism,
ferritransferrin (ferri-Tf), has the ability to influence TfR-shedding. In
HL60- and TRVb-cells increasing ferri-Tf concentrations leads to decreased TfR
release, independent of cellular TfR-expression. Experimental analysis of
cells expressing TfR-mutants with different affinities for ferri-Tf shows,
that the inhibition effect of ferri-Tf is dependent on its binding to the TfR.
The same effect is also observed in membranes indicating that the inhibition
mechanism is independent of signal transduction or endocytosis effects. The
inhibitory effect is thus rather a result of a competitive interaction between
ferri-Tf and the protease for the TfR. The known crystal structure of the
ferri-Tf:TfR complex suggests that binding of ferri-Tf to the TfR prevents an
interaction of the protease with the stalk-region of the TfR. The conclusions
of this study are summarised in a model. The release of sTfR is controlled by
cellular iron demand as well as by iron availability. Released sTfR can be
buffered in the blood stream by ferri-Tf, thereby local effects only influence
the iron metabolism, if the systemic balance is changed. The here presented
study gives new insight into the function of the sTfR and shows for first time
how its release is regulated.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
transferrin receptor
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Funktion und Regulation der Transferrinrezeptorfreisetzung
dc.contributor.firstReferee
Priv. Doz. Dr. Hendrik Fuchs
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Mathias Ziegler
dc.date.accepted
2005-05-20
dc.date.embargoEnd
2005-10-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2005001261
dc.title.translated
Function and Regulation of Transferrin Receptor Shedding
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001626
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2005/126/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000001626
dcterms.accessRights.dnb
free
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open access