In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine molekulare Analyse des RCMV CD200-Homologes (vCD200). Die Entdeckung und Charakterisierung viraler Homologe zu zellulären Genen ist sowohl aus humanmedizinischer als auch veterinärmedizinischer Sicht ein wichtiger Aspekt der virologischen Forschung. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn virale Proteine immunmodulatorische Eigenschaften besitzen. Die Beschreibung gerade solcher Mechanismen verbessert das Verständnis der Virus-Wirt-Interaktion und stellt eine Grundlage für die Entwicklung neuer antiviraler Substanzen dar. Voraussetzung solcher Untersuchungen in vivo ist das Vorhandensein eines Modellsystems, wozu in der vorliegenden Arbeit das RCMV genutzt wurde, sowie eine Vielzahl virologischer und immunologischer Werkzeuge für eine umfangreiche Genanalyse. Das RCMV CD200-Homolog (vCD200) bindet an einen inhibitorischen Rezeptor (CD200R), der auf Makrophagen exprimiert wird. Bereits untersuchte virale CD200-Homologe führten zur Formulierung einer Hypothese: nach Infektion von Zellen mit RCMV führt die Bindung des vCD200 an den CD200R zu einer verminderten Aktivierung von Makrophagen und damit zu einer geringeren Produktion des Enzyms iNOS innerhalb dieser Zellen. Dies resultiert in einer verminderten NO-Ausschüttung durch die Makrophagen, und somit einer verringerten Entzündungsreaktion im umliegenden Gewebe. Infolgedessen wird die Replikation der Viren durch verminderte inflammatorische Stimuli im Gewebe erleichtert.Im ersten Teil der Arbeit wurde eine RCMV CD200-Revertante (RCMV-revCD200) zur bereits bestehenden RCMV CD200-Deletionsmutante (RCMV-ΔCD200) des RCMV-E Wildtyp-Virus (RCMV-wt) hergestellt. Diese wurde in vitro charakterisiert und wies die gleichen Eigenschaften wie RCMV-wt auf. Alle drei Viren zeigten auf Rattenembryofibroblasten (REF) vergleichbare Wachstumseigenschaften. Im Anschluss wurden Lysate einer REF/Makrophagen co-Kultur mithilfe des Western Blot untersucht. Dazu wurden zunächst REF mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert, und 24 h später die gleiche Anzahl Makrophagen zu den infizierten REF gegeben. Weitere 24 h später wurden die Lysate aus dem Zellgemisch gewonnen. Das Lysat der co-Kultur, die mit RCMV-ΔCD200 infiziert worden war, zeigte, entsprechend der Hypothese, eine dezent höhere iNOS- Expression im Vergleich zu den anderen Lysaten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden (TaqMan-PCR und Durchflusszytometrie) zum Nachweis und zur Quantifizierung der Gene CD200, vCD200, CD200R und iNOS etabliert. Es wurde Gewebematerial (peritoneale Exsudatzellen und Milz) aus Ratten, die mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert worden waren, ex vivo untersucht. Entgegen der in der Hypothese formulierten Annahme zeigten die peritonealen Exsudatzellen von Tieren, die mit RCMV-wt oder RCMV-revCD200 infiziert worden waren, im Vergleich zu den Zellen von Tieren, die mit RCMV- ΔCD200 infiziert worden waren, keine verringerte iNOS-Produktion. Das gleiche gilt auch für die Untersuchungen der Milz der Tiere. Eine Transkription der Gene vCD200, CD200 und CD200R konnte in den untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Durch Quantifizierung des Virushüllproteins Glykoprotein B konnte eine vergleichbare Viruslast aller infizierten Tiere zwei und sechs Tage nach Infektion gezeigt werden. Mithilfe der Virustitration konnte zwei Tage nach Infektion Virus in der Milz und Leber infizierter Tiere nachgewiesen werden. Einen überraschenden Befund stellte die im Rahmen einer immunhistochemischen Färbung durchgeführte Betrachtung der Expression der MHC-Klasse-II-Moleküle in der Milz der Tiere dar. Die Milz-Schnitte zeigten, dass alle mit RCMV-ΔCD200 infizierten Tiere eine deutlich stärkere Expression von MHC-Klasse-II- Molekülen aufwiesen, als mock-infizierte oder mit RCMV-wt und RCMV-revCD200 infizierte Tiere.
The aim of the presented work was to accomplish a functional analysis of the RCMV CD200- homologue (vCD200). The better understanding of viral homologues leads to a better understanding of the virus-host-interactions which opens new possibilities to develop efficient drugs. The premise for an in-vivo analysis is the existence of an animal model which is given here by RCMV. vCD200 binds to an inhibitory receptor (CD200R) that is mainly expressed on myeloid cells, e.g.macrophages. Myeloid cells can be regulated through cell-cell interactions that are triggered by matched sets of activating of inhibitory receptors. The results of other studies that proved an inhibitory role for other, already better known, viral CD200-homologues lead to forming a hypothesis about the function of the RCMV CD200-homologue: The interaction between vCD200 and the CD200R leads to an inhibitory effect within the macrophage resulting in less production of the enzyme iNOS. This means less generation of NO in the surrounding tissues finally resulting in less inflammation. Gaining a gene that mediates a function like that is of huge benefit for the virus because less inflammation in tissues surrounded by virus infected cells means easier replication for the virus within its host. In the first part of the presented work a recombinant virus (RCMV-revCD200) of the already existing RCMV CD200 deletion mutant (RCMV-ΔCD200) was produced via co-transfection and tested in vitro. RCMV-revCD200 and RCMV-ΔCD200 were compared with the RCMV wildtype virus (RCMV-wt) and it was shown that all three viruses had the same replicationabilities in vitro. Afterwards a cell co-culture of macrophages and fibroblastic cells were infected with the three viruses (RCMV-wt, RCMV- revCD200, RCMV-ΔCD200) and iNOS expression was investigated in western blot. According to the hypothesis, the cells of the co-culture that was infected with RCMV-ΔCD200 showed a slightly higher expression of iNOS. In the second part of the presented work tissues from animals infected with RCMV-wt, RCMV- revCD200, RCMV-ΔCD200 were investigated with methods that allow a quantification of the results found in the in vitro studies. To accomplish this quantitative experiments were established such as fluorescence activated cell sorting (FACS) and TaqMan-PCR. Macrophages gained from the peritoneum of the animals were examined for iNOSproduction in FACS and TaqMan-PCR. Additionally the expression of the genes vCD200, CD200, CD200R and iNOS were analysed in the peritoneal cells as well as in the spleen of the animals. A result of lower expression of iNOS in the macrophages of those animals infected with RCMV-wt or RCMV-revCD200 in comparison with RCMV-ΔCD200 could not be found in the presented work. The transcription of the genes playing a role in the inhibition of the macrophages: vCD200, CD200 and CD200R could be detected in the investigated tissues of the animals. All animals got tested for expression of gB and it could be shown that all animals that were infected with the viruses were equally positive for gB expression.Virus was detected with plaque assay in both liver and spleen of infected animals two days after infection. A surprising finding could be obtained in an immune histochemical staining of the spleens for the MHC-class-II-molecule. This glycoprotein plays an important role within the antigen presentation of body-foreign peptide fragments towards CD4+ T-cells. These cells then activate other cells of the immune systems which can lead to an elimination of the pathogen. In the spleens of uninfected animals or those animals infected with the RCMV-wt or RCMVrevCD200 compared to those animals infected with RCMV-ΔCD200 showed less expression of MCH class-II molecules.
