The main topic of this thesis is the application of NMR for protein structure determination in the context of a structural genomics project. The structures of three small protein domains are presented within their biological context together with additional experiments that relate the structures to the possible functions of the proteins. After an introduction to the field in chapter 1 covering recent developments in structural genomics and protein structure determination by NMR, a method that allows the assignment of amino acid types in larger proteins is presented in chapter 2. This method relies on different 13C-labelling patterns obtained from biosynthetical labelling with either 1,3-13C-glycerol or 2-13C-glycerol. First results obtained on a small test protein, the SH3-domain from α-spectrin, are reported. It is possible to assign all N-H crosspeaks from this protein to the correct pair of amino acid- types. Furthermore, unambiguous sequence specific assignments for 19 of the 62 amino acids of the α-spectrin SH3 domain could be obtained using this method. In chapter 3, the structures of three small protein domains are presented. The BAG-domain from Silencer of Death Domains (SODD) shows a three helix bundle and is a representative of a new shorter subclass of BAG-domains. In a homology model of the complex with its interaction partner HSP70, new subclass-specific interactions were identified. The structure of the oxidized Complex I subunit B8 (CI-B8), presented in the following section, is the first structure at atomic resolution obtained from a Complex I subunit. It is a single domain protein showing a mixed parallel anti-parallel β-sheet accompanied by three α-helices, that is identified as a thioredoxin-fold. The homology to thioredoxins includes the overall position of the disulfide bond. The redox-potential that was measured to be 251,6 mV is comparable to that of thioredoxins. This suggests a thioredoxin-like function of subunit B8 within Complex I. The third protein described in this thesis is an An1-like Zinc finger domain from the hypothetical protein BC018415. Apart from two very short stretches of β-sheet, it does not display any regular secondary structure, while the core of the protein is dominated by its two zinc centers. In the last section of chapter 3, the structure determination process of the three proteins is compared and an optimized strategy of structure calculation and refinement is presented. This strategy allows taking advantage of the increased speed of automated NOE-assignment algorithms without sacrificing the quality of the obtained structures.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Anwendung der Proteinstrukturbestimmung mittels NMR im Rahmen eines Structural Genomics Projektes. Die Strukturen von drei kleinen Proteindomänen und Proteinen werden zusammen mit ihrem jeweiligen biologischen Hintergrund präsentiert. Darüberhinaus wurden weitere Experimente zur Untersuchung der Struktur-Funktions-Beziehungen durchgeführt und vervollständigen die jeweiligen Abschnitte. Nach einer kurzen Einführung in das Gebiet der Structural Genomics und der neueren Entwicklungen im Bereich der NMR-Proteinstrukturbestimmung in Kapitel 1 wird in Kapitel 2 eine neue Methode zur Zuordnung von Aminosäure-Typen präsentiert. Diese Methode beruht auf unterschiedlichen 13C-Markierungsmustern, die biosynthetisch entweder durch den Einsatz von 1,3-13C-Glycerin oder 2-13C-Glycerin erzeugt werden können. Die Ergebnisse, die mit dieser Methode an einem kleinen Testprotein, der SH3-Domäne aus α-Spektrin, erzielt werden können, sind vielversprechend. So ist es möglich, alle N-H Kreuzsignale des Proteins dem korrekten Paar von Aminosäuretypen zuzuordnen. Darüberhinaus können im Fall von α-Spektrin SH3 mit dieser Methode 19 der 62 im Protein enthaltenen Aminosäuren eindeutig zugeordnet werden. In Kapitel 3 werden die NMR-Strukturen dreier kleiner Domänen und Proteine beschrieben, welche im Rahmen dieser Arbeit bestimmt wurden. Die BAG-Domäne aus dem Protein Silencer of Death Domains (SODD) besteht aus einem Drei-Helix-Bündel und repräsentiert eine kürzere Unterfamilie der BAG-Domänen. Im Modell des Komplexes der SODD BAG-Domäne mit HSP70, welches mittels Homologiemodelling erstellt wurde, konnten neue Interaktionen identifiziert werden, die für die kurze Unterfamilie der BAG- Domänen spezifisch sind. Die Struktur der oxidierten B8-Untereinheit aus Komplex I (CI-B8), welche im darauffolgenden Abschnitt beschrieben wird, zeigt ein gemischtes β-Faltblatt, dessen eine Seite mit drei α-Helices wechselwirkt. Die Struktur der einzigen Proteindomäne zeigt strukturelle Homologie zu Thioredoxinen, und das Redox-Potential von 251,6 mV liegt ebenfalls im Bereich der Redox-Potentiale typischer Vertreter der Thioredoxin-Familie. Da außerdem die Disulfid-Brücke von CI-B8 in einem ähnlichen Bereich der Struktur lokalisiert ist, kann davon ausgegangen werden, dass CI-B8 innerhalb von Komplex I eine Thioredoxin-ähnliche Funktion haben könnte. Als drittes wird in diesem Kapitel die Struktur einer An1-ähnlichen Zink-Finger-Domäne aus dem hypothetischen Protein BC018415 beschrieben. Diese zeigt nur in zwei sehr kurzen β-Faltbättern eine reguläre Sekundärstruktur und wird von den beiden Zink-Komplexen im Kern dominiert. Den Abschluss von Kapitel 3 bildet eine vergleichende Betrachtung des Strukturbestimmungsprozesses der drei Proteine. Daraus wird eine Strategie zur Berechnung von NMR Strukturen entwickelt, welche die Geschwindigkeitsvorteile neuer automatischer NOE-Zuordnungsroutinen nutzt, ohne jedoch von den Qualitätsstandards manueller NMR-Strukturbestimmung abzuweichen.
