Generation of recombinant antibody fragments toward the tumour-associated Thomsen-Friedenreich disaccharide

Abstract

The main goal of the thesis is the, "Generation of antibody fragments toward the tumour-associated Thomsen-Friedenreich antigen" using recombinant antibody technologies. The TF disaccharide is a tumour-specific pan-carcinoma marker, which occurs only on tumours and virtually not on normal tissues. The exceptional tumour specificity renders it a prime goal for tumour therapy and diagnosis. Despite the thorough investigation of TF, the only TF-specific antibodies reported so far were of the IgM type which are not suitable for the treatment of small primary carcinomas, metastasis or minimal residual disease. In contrast to protein epitopes against which scFv can readily be generated by using phage display systems, it was not possible to obtain scFv against the small non-charged carbohydrate TF epitope. This was shown to be due to the lower intrinsic affinity of a single anti-TF binding site. The breakthrough was achieved by establishing a new multivalent scFv phage-display format based on the display of scFvs with dramatically shortened linkers (1aa) using a phagemid system. scFv(1aa)-libraries were generated using spleenocytes from immunised mice. TF-specific multivalent scFvs were successfully selected and the most promising clones were evaluated in ELISA, immunocytology, -histology, surface plasmon resonance and size exclusion chromatography. Successive shortening of the scFv linker from 18 to 0 amino acids directed the formation of multimeric scFv complexes from dimers, trimers to tetramers in solution, which correlated with an increasing functional affinity, and thus indicates that multimers are also present on the phage particle. The most promising clone showed an outstanding TF-specificity and an affinity of ~20 nM, which is very high for a carbohydrate specific antibody fragment. Interestingly the sequence variability of the clones generated was very low and the affinity could not be improved by affinity maturation indicating a small optimal sequence window for TF-specific antibodies. Another breakthrough was the successful generation of stable multimers, their purification, conjugation with the chelator DTPA, 111In labelling, and in vitro characterisation. Two different xenograft mice tumour models were used showing for the first time, successful in vivo targeting of TF with good tumour-uptake. The kidney burdens were low compared to other recombinant antibody fragments from the literature, particularly for the tetrameric scFv(0aa) construct. This shows that these multimeric scFvs are highly tumour-specific and suitable for the development of RAIT. In summary, the first stable multivalent TF-specific antibody fragments were generated as a basis for the development of highly tumour- specific RAIT. A novel multimeric phage display methodology was established which is likely to be useful for the generation of carbohydrate-specific antibodies and other antibodies with lower affinities in single binding domains.

Das Hauptziel der Dissertation ist die "Generierung von Antikörperfragmenten gegen das Tumor-assoziierte Thomsen-Friedenreich Antigen" unter Verwendung rekombinanter Antikörpertechnologien. Das TF-Disaccharid ist ein Tumor- spezifischer pan-karzinomer Marker, der nur auf Tumoren und so gut wie nicht auf Normalgewebe vorkommt. Die außergewöhnliche Tumorspezifität macht es zu einem wichtigen Ziel für die Tumortherapie und -diagnose. Trotz der gründlichen Erforschung von TF sind bis heute nur TF-spezifische Antikörper des IgM Typs beschrieben, welche für die Behandlung von kleinen Primärkarzinomen, Metastasen oder der minimalen Resterkrankung nicht geeignet sind. Im Gegensatz zur relativ einfachen Generierung von scFv gegen Proteinepitope unter Verwendung des Phagendisplay-Systems war es nicht möglich, scFv gegen das kleine ungeladene TF Kohlenhydratepitop zu gewinnen, was an der geringeren intrinsischen Affinität einer einzelnen anti-TF Bindungsstelle lag. Der Durchbruch kam durch die Etablierung eines neuen multivalenten scFv-Phagendisplay-Formats auf Grundlage der Verwendung von scFv mit stark verkürztem Linker (1aa) im Phagemid-System. Es wurden scFv(1aa)-Bibliotheken aus Spleenozyten von immunisierten Mäusen hergestellt. Daraus wurden erfolgreich TF-spezifische multivalente scFv selektioniert und die vielversprechendsten Klone im ELISA, in der Immunzytologie und -histologie, im BIACORE und in der Größenausschlußchromatographie untersucht. Die stufenweise Verkürzung des scFv-Linkers von 18 auf 0 Aminosäuren hat die Bildung von multimeren scFv-Komplexen (Dimere, Trimere und Tetramere) in Lösung zur Folge, was mit einer ansteigenden funktionellen Aktivität korreliert und darauf hindeutet, daß auch auf den Phagenpartikeln Multimere vorliegen. Der vielversprechendste Klon zeigte eine außergewöhnliche TF- Spezifität und eine Affinität von ca. 20 nM, was für ein Kohlenhydrat- spezifisches Antikörperfragment sehr hoch ist. Interessanterweise war die Sequenzvariabilität der gewonnenen Klone sehr niedrig und die Affinität konnte nicht durch Affinitätsreifung verbessert werden, was nahelegt, daß es nur ein schmales Fenster für eine optimale Sequenz TF-spezifischer Antikörper gibt. Einen weiteren Durchbruch stellte die erfolgreiche Herstellung eines stabilen Multimers, dessen Aufreinigung, der Konjugation des Multimers mit dem Chelator DTPA, dessen 111In-Markierung und in vitro Charakterisierung dar. Es wurden zwei verschiedene Maustumormodelle (Xenograft) verwendet und es konnte zum ersten Mal erfolgreich eine Markierung des TF-Antigens in vivo gezeigt werden mit einer relativ guten Aufnahme des Multimers in den Tumor. Die Nierenbelastung war verglichen mit anderen in der Literatur beschriebenen rekombinanten Antikörperfragmenten niedrig, insbesondere für das tetramere scFv(0aa)-Konstrukt. Dies zeigt, daß diese multimeren scFv eine sehr hohe Tumorspezifität besitzen und für die Entwicklung einer Radioimmuntherapie geeignet sind. Zusammengefaßt wurde das erste stabile multivalente TF- spezifische Antikörperfragment als Grundlage für die Entwicklung einer hochspezifischen Tumor-Radioimmuntherapie hergestellt. Es wurde eine neue multimere Phagendisplay-Methode etabliert, die voraussichtlich für die Herstellung von Kohlenhydrat-spezifischen Antikörpern und anderen Antikörpern mit geringer intrinsischer Affinität für die einzelne Bindungdomäne angewendet werden kann.