Conformational diseases or endoplasmatic reticulum (ER) storage diseases are a class of disorders associated with aberrant protein accumulation in tissues and cellular compartments of the secretory pathway. To date, more and more diseases are discussed to be linked to ER stress and the induction of two specific signaling pathways, the unfolded protein response (UPR) and the ER- overload response (EOR). One of them may be the X-linked nephrogenic diabetes insipidus (NDI), which is characterized by the inability of the kidney to absorb water in response to the hormone arginin vasopressin (AVP). This rare hereditary disorder is induced by different mutations within the sequence of the AVPR2 gene resulting in misfolded V2 vasopressin receptors (V2R), which are transport-defect and therefore among other effects intracellularly retained. Besides the disturbed water absorption little is known about the additional cellular effects of these retained receptor proteins. Therefore the human V2R and several naturally occurring disease-causing mutants were used as model proteins to study the effects of the intracellular retention of misfolded proteins in different compartments of the secretory pathway, namely the ER, ERGIC and Golgi apparatus. In this study the detection and characterization of ER stress induced upon expression of misfolded proteins was carried out showing for the first time that the UPR but not the EOR was activated after stable and/or transient expression of misfolded V2Rs in HEK293 cells. The induction of the UPR was measured by an upregulation of different chaperones by immunoblot analysis and luciferase assay and verified by an extensive activation study of the three known UPR-specific pathways. Simultaneously, analyses of activation of the transcription factor NF-kappaB as an indicator of EOR revealed no participation of this ER stress pathway in cells expressing NDI-causing mutants. Furthermore, it could be shown that different mutants of a single receptor protein activated different UPR branches. The ER-retained mutant L62P and the ER/ERGIC-localized mutant InsQ292 induced the PERK and ATF6 pathways while mutant G201D, which reaches the Golgi network, exclusively activated the IRE-1 pathway. In addition, the rescue of the intracellularly retained murine V2R to the plasma membrane by different pharmaco- and chemical chaperones resulted in a reduction of UPR detected by a decreased expression of chaperones GRP78 and GRP94 and a reduced activation of the PERK target eIF2. Micro array analysis of cells expressing ER-retained mutant L62P revealed new and yet unknown target genes of UPR. Some of them were involved in redox regulation and the negative regulation of apoptosis and therefore elucidated novel and as yet undescribed possibilities to inhibit cell death after persistent ER stress. Furthermore, the analysis of the three known UPR transducers revealed the chaperone GRP94 as a novel interaction partner of the transcription factor ATF6, possibly connected with ER stress. Until this work, the activation of UPR and induction of ATF6 were assumed to be exclusively regulated by binding and dissociation of GRP78. Finally, the usually ER-resident molecular chaperone GRP94 could be found in the nucleus in cells expressing ER-retained mutant L62P for the first time, which was verified by different methodical approaches and pointed to a possible adaptive function resulting in the survival of the cells upon persistent ER stress.
Bei Proteinfaltungskrankheiten wie zystischer Fibrose wird heutzutage angenommen, dass die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum (ER) für das Auftreten von ER-Stress und die Aktivierung ER-Stress-vermittelter Signalwege verantwortlich ist. Die Hauptsymptome dieser Erkrankungen werden durch das Fehlen des Proteins an seinem Wirkort verursacht, aber ER-Stress kann die Krankheitssymptome zusätzlich verstärken. Spezifische Signalwege werden daraufhin als Antwort aktiviert. Über die UPR („unfolded protein response“) wird die Expression von Chaperonen verstärkt, während die EOR („ER overload response“) zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kB führt. Das Modellprotein dieser Arbeit, der humane V2 Vasopressin Rezeptor (V2R) gehört zu der Familie der G-Protein- gekoppelten Rezeptoren und wird überwiegend im Sammelrohres der Niere exprimiert. Mutationen in der Sequenz des AVPR2-Genes können zu fehlgefalteten, transportdefekten Rezeptoren führen. Ein Großteil dieser Rezeptoren wird vom Qualitätskontrollsystem der Zelle erkannt und intrazellulär zurückgehalten. Durch die verminderte Rezeptorzahl an der Plasmamembran kommt es bei diesen Patienten zu einer stark erhöhten Wasserausscheidung. Neben der gestörten Wasserrückresorption ist allerdings nur wenig von anderen Auswirkungen bekannt, die auf die Retention der fehlgefalteten Rezeptoren zurückzuführen sind. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit bei HEK293 Zelllinien, die stabil und transient den humanen V2R und einige in Patienten gefundene krankheitsauslösende Mutanten exprimieren, die Auswirkungen der intrazellulären Retention von fehlgefalteten Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten des sekretorischen Signalweges untersucht. Das Vorliegen einer UPR konnte durch eine verstärkte Expression von Chaperonen und der Aktivierung der drei UPR spezifischen Signalwegen bestätigt werden. Die Analyse der Aktivitatät von NF-kappaB verdeutlichte hingegen das Fehlen einer Antwort in Form des EOR. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass nicht jede Fehlfaltung eine Aktivierung der gleichen UPR Wege mit sich führt. So waren bei HEK293 Zellen, die stabil die ER-retinierte Mutante L62P und die in ER und ERGIC lokalisierte Mutante InsQ292 exprimieren, die Signalwege über die Stress-Sensoren PERK und ATF6 aktiviert, während die Retention im Golgi-Apparat (G201D) nur zu einer Aktivierung des IRE-1 Signalweges führt. Außerdem führte die Zurückführung (Rescue) an die Plasmamembran des ebenfalls intrazellulär zurückgehaltenen murinen V2R (mV2R) durch Behandlung mit Pharmako-Chaperonen und DMSO als chemisches Chaperon zu einer Verringerung des UPR. Dies konnte durch eine reduzierte Expression von Chaperonen gezeigt werden. Durch Micro Array Analysen von HEK293 Zellen, die stabil die ER-retinierte Mutante L62P exprimieren, konnten neue Zielgene der UPR gefunden werden, die u. a. Redox Regulation und die negative Regulation der Apoptose beinhalteten. Die genauere Analyse dieser Signalwege konnte neue Mechanismen zur Apoptose-Hemmung trotz chronischer ER-Stress Bedingungen aufdecken. Zusätzlich wurde das Chaperon GRP94 durch Immunopräzipitations- Analysen als neuer Interaktionspartner des UPR Transkriptionsfaktors ATF6 gefunden, der möglicherweise als zusätzlicher Regulator des Signalübermittlers bei ER-Stress fungiert und unter diesen Bedingungen zum ersten Mal auch im Kern detektiert wurde.
