Mechanismen der Transzytose von Makromolekülen bei Morbus Crohn: Untersuchungen am Zellmodell T84 und an humanen Kolon-Biopsien

Abstract

Eines der Hauptmerkmale in der Funktionalität der chronisch entzündlichen Darmerkrankung Morbus Crohn ist die erhöhte Durchlässigkeit der im Rahmen der Entzündung geschädigten Darmbarriere. In dieser Arbeit wurden verschiedene bei Morbus Crohn relevante Mediatoren, namentlich IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, IFNγ und Histamin, auf ihre Transzytose-steigernde Wirkung im Zellmodell untersucht. Dazu wurde die humane Kolonkarzinomzelllinie T84 verwendet, da diese rege Endozytoseeigenschaften aufweist und als Marker für die Transzytose wurde die Meerrettich-Peroxidase (HRP) verwendet. Von allen untersuchten Zytokinen erhöhte lediglich IL-4 die HRP-Permeabilität in einem relevanten Ausmaß. Deshalb wurden die Auswirkungen dieses Zytokins auf weitere barriererelevante Eigenschaften untersucht. Dazu wurde die Expression der TJ- Proteine Claudin-1, -2, -3, -4, -5, -7 und -8 sowie Occludin und Tricellulin unter dem Einfluss von IL-4 mittels Western Blot analysiert. Dies ist die erste so umfassende Analyse der TJ-verändernden Wirkung von IL-4 auf intestinale Zellen überhaupt. Das kanalbildende Claudin-2 zeigte eine deutlich erhöhte Expression, während das abdichtend wirkende Claudin-4 vermindert exprimiert wurde. Alle anderen untersuchten TJ-Proteine waren unverändert. Weiterhin wurde der transepitheliale Widerstand analysiert, welcher durch Inkubation mit IL-4 vermindert ist. Mittels Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie konnten wir zeigen, dass der durch IL-4 verursachte Abfall des transepithelialen Widerstands etwa gleichermaßen durch Änderungen des transzellulären und des parazellulären Widerstands zustande kommt. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Identifizierung des Endozytoseweges, auf dem HRP durch den Zellmonolayer transportiert wird und die Beantwortung der Frage, ob unter entzündlichen Bedingungen, die durch IL-4 induziert wurden, zusätzliche beziehungsweise andere Wege beteiligt sind. Dazu wurden spezifische Inhibitoren für die Clathrin-vermittelte Endozytose, die Caveolin- vermittelte Endozytose und die Makropinozytose eingesetzt und die Veränderung der HRP-Permeabilität unter dem Einfluss dieser Inhibitoren gemessen. Um diese Ergebnisse zu unterstützen, wurde eine Methode etabliert, um HRP immunfluoreszent darzustellen. Durch die parallele Färbung verschiedener intrazellulärer Vesikel konnte die Lokalisation von HRP zu frühen und späten Zeitpunkten (2 – 30 Minuten) der Transzytose nachgewiesen werden. Mit Hilfe der Immunfluoreszenzfärbungen und der Permeabilitätsmessungen konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass HRP hauptsächlich durch die Caveolin-vermittelte Endozytose, aber auch durch die Makropinozytose durch das Epithel transportiert wird. Die Relevanz dieser Ergebnisse für Morbus Crohn-Patienten wurde dann anhand von Vergleichen der HRP-Permeabilität zwischen Biopsien von gesunden Kontrollpatienten und Patienten mit Morbus Crohn überprüft, indem einige der im Zellmodell wirksamen Inhibitoren eingesetzt wurden und ihre Wirksamkeit im nativen Darm getestet wurde. Hier konnten wir zum einen bestätigen, dass die HRP-Permeabilität von Patienten mit Morbus Crohn gegenüber Kontrollpatienten erhöht ist. Zum anderen konnten wir zeigen, dass die HRP-Transzytose auch im nativen Darm über Caveolin-vermittelte Endozytose und Makropinozytose stattfindet.

A main feature of the inflammatory bowel disease Crohn’s disease is the increased permeability of the disturbed intestinal barrier. In this study we investigated several mediators pertinent to Crohn’s disease in regard to their ability to enhance transcytosis. In particular we investigated the effects of IL-1β, IL-4, IL-6, TNFα, IFNγ and histamine on the human colon carcinoma cell line T84, which was chosen because of its endocytotic properties. As a marker for transcytosis we used horseradish peroxidase (HRP). Only IL-4 increased the permeability for HRP to a relevant extent. Therefore, the impact of this cytokine on other barrier properties was investigated. The influence of IL-4 on the expression of the tight junction (TJ) proteins claudin-1, -2, -3, -4, -5, -7 and -8 as well as occludin and tricellulin was investigated by means of western blot analyses. This is the first analysis of the effect of IL-4 on TJ proteins in intestinal cells to such an extent. The channel-building claudin-2 showed an enhanced expression, whereas the expression of the tightening claudin-4 was decreased. The remaining TJ proteins remained unchanged. In addition the transepithelial resistance was analysed, which is reduced in T84 monolayers after the incubation with IL-4. By means of two-path-impedance spectroscopy we could show that the paracellular as well as the transcellular resistance were decreased by IL-4 and both account for the decrease in transepithelial resistance. The main goal of this study was to elucidate the endocytotic pathway of HRP and furthermore to study if there are additional or other pathways that are involved under inflammatory conditions, which are elicited by IL-4. For that purpose we used inhibitors specific for either clathrin mediated endocytosis, caveolin mediated endocytosis or macropinocytosis and measured the changes in the permeability for HRP in response to these inhibitors. To validate these results we established a method to immunofluorescently stain intracellular HRP. Through co-staining of several intracellular vesicles the localization of HRP in early and late stages (2 – 30 minutes) of transcytosis could be demonstrated. By means of the immunofluorescent staining and the permeability measurements we showed that HRP is transported mainly via caveolin mediated endocytosis but also via macropinocytosis. The relevance of these results for patients with Crohn’s disease was examined by comparing the permeability for HRP in patients with Crohn’s disease and healthy controls. Biopsies from both groups were treated with some of the inhibitors found to be effective in cell culture. We confirmed that the permeability for HRP of patients with Crohn’s disease is elevated compared to healthy controls and further we could show that in the native intestine the transcytosis of HRP also proceeds via caveolin mediated endocytosis and macropinocytosis.