Claudin (Cldn)-5 is thought to dominate the tight junctions (TJs) of the blood-brain barrier (BBB) with minor contribution of Cldn3, -12 and occludin (Ocln). However, in Cldn5 knockout mice the BBB appears ultrastructurally normal (Nitta et al., 2003). Therefore, the involvement of further Cldns and TJ-associated MARVEL proteins (TAMPs) can be hypothesized. Laser-dissected brain capillaries exhibit a high expression of Cldn1, -5, -11, -12, -25 and Ocln, as well as Cldn20 and -26 in mice or Cldn9 and -27 in human. Below one percent of total Cldn/ TAMP mRNA, tricellulin and 10 further Cldns in mice and 9 partially different Cldns in human are found. mRNA values correlate with protein expression, quantified by a novel epitope dilution assay. In brain sections, Cldn3, -4, -5, -11, -12, -20 and -25 are enriched at TJs of capillaries. Cldn25 with ~50% of total Cldn/ TAMP mRNA, the strongest expressed TJ protein at the human BBB, neither tightens the paracellular barrier nor interconnects opposing cells through loop interactions. But a contribution to the proper TJ strand morphology, possibly through interactions with other TJ associated proteins is found. Despite lack of the typical PDZ binding motif, interaction of Cldn25 with the PDZ1 domain of zonula occludens protein 1 is as pronounced as for classic Cldns. Besides, glycosylation of the extracellular loop of Cldn25 is found to be crucial for the localization at the plasma membrane. During post ischemic reperfusion Cldn5 is transcriptionally up-regulated, supporting a re-establishment of TJs at the BBB. Cldn1, -3, -12 and Ocln are down-regulated in the early phase of reperfusion associated with disassembly of TJs due to ischemia. Inversely, Cldn1 expression is strongly up-regulated in brain endothelial cells upon silencing of Cldn5. Collectively, in the first complete Cldn/ TAMP profile, in addition to Cldn5, seven high and eleven low abundant TJ proteins in the brain endothelium become evident and new insights in their interdependent regulation are found. Human and mouse share a common profile ex vivo but differ substantially in quantity. Moreover, in vitro BBB models of isolated endothelial cells are missing ex vivo-complexity and hence, are of limiting informational value. A misconception of the complexity of BBB TJs with respect to Cldn expression was revealed. Furthermore new potential drug targets to modulate the permeability of the BBB were identified.
Derzeit wird angenommen, dass die Tight Junctions (TJs) der Blut-Hirn-Schranke (BHS) hauptsächlich von Claudin (Cldn)-5 und nur zu geringem Anteil von Cldn3, -12 und Occludin (Ocln) gebildet werden. Die elektronenmikroskopische Analyse der BHS in einem Cldn5 Knockout-Maus Modell zeigt jedoch strukturell normale TJs (Nitta et al., 2003). Daher kann die Beteiligung weiterer Claudine und TJ- assoziierter MARVEL Proteine (TAMPs) angenommen werden. In Gehirnkapillaren, die mittels Laser-Mikrodissektion isoliert wurden, konnte eine relativ starke Expression von Cldn1, -5, -11, -12, -25 und Ocln sowie Cldn20 und -26 in der Maus oder Cldn9 und -27 im Menschen gefunden werden. Tricellulin sowie 10 weitere Claudine in der Maus und 9 zum Teil andere Claudine im Menschen sind unter einem Prozent der Gesamttranskriptmenge aller Claudine und TAMPs exprimiert. Eine Korrelation von Transkriptmenge und Proteingehalt, welcher mittels einer neuen Epitop Verdünnungsanalyse ermittelt wurde, konnte festgestellt werden. In Hirnschnitten sind Cldn3, -4, -5, -11, -12, -20 und -25 an den TJs von Kapillaren angereichert. Cldn25 ist mit ~50% der Gesamttranskriptmenge aller Claudine und TAMPs das höchst exprimierte TJ Protein der humanen BHS. Es hat weder eine parazellulär abdichtende Funktion, noch trägt es zur Adhäsion benachbarter Zellen durch Assoziation der extrazellulären Schleifen bei. Es konnte allerdings ein Einfluss auf die TJ Strang Morphologie, möglicherweise über Bindung an TJ assoziierte Proteine, nachgewiesen werden. Cldn25 bindet, trotz Abweichung vom PDZ Bindungsmotiv, gleichermaßen an Zonula Occludens Protein 1 wie klassische Claudine. Außerdem konnte eine Glykosylierung der ersten extrazellulären Schleife von Cldn25 als essentiell für die Lokalisation in der Plasmamembran identifiziert werden. Bei Reperfusion der Blutgefäße nach zerebraler Ischämie konnte eine Erhöhung der Transkriptmenge von Cldn5 in Kapillaren festgestellt werden. Erhöhte Synthese von Cldn5 ist für die Bildung neuer TJs erforderlich und erklärt die phasische Entwicklung der BHS Durchlässigkeit. Die mRNAs von Cldn1, -3, -12 und Ocln waren dagegen in der frühen Phase der Reperfusion als Folge zerebraler Ischämie reduziert. In Kultur von Hirnendothelzellen führt die Reduktion von Cldn5 zu einer stark erhöhten Transkription von Cldn1. In dieser Arbeit wurde erstmals die Expression aller Claudine und TAMPs untersucht. Neben Cldn5 konnten sieben stark und elf schwach exprimierte TJ Proteine im Hirnendothel nachgewiesen werden und Hinweise auf eine gegenseitige Regulation gefunden werden. Die BHS von Mensch und Maus ist in ihrer Claudin Komposition vergleichbar, unterscheidet sich aber in der Quantität einzelner TJ Proteine. BHS Modelle isolierter Hirnendothelzellen in vitro sind in ihrer Komplexität bezogen auf die TJ Komposition eingeschränkt, weshalb deren Einsetzbarkeit kritisch betrachtet werden sollte. Die Annahme, dass die TJs der BHS in Bezug auf die Expression von Claudinen weniger komplex als TJs von Epithelien sind, konnte widerlegt werden. Des Weiteren wurden neue Zielproteine für die Modulation der BHS Permeabilität identifiziert.
