Proteintherapeutika werden häufig in lyophilisierter Form gelagert, um die Stabilität über eine längere Dauer zu gewährleisten. Vor Applikation in den Patienten wird durch Rekonstitution die fertige Proteinlösung erhalten. Durch Adsorption des Proteins an das Primärpackmittel kann es zu einem Konzentrationsverlust in Lösung kommen. Dies stellt sowohl für den Therapieerfolg als auch für die pharmazeutische Industrie ein Problem dar. In der Literatur wurde bereits die Adsorption verschiedener therapeutischer Proteine an verschiedene Primärpackmittel beschrieben. Durch unterschiedliche Eigenschaften des Proteins als auch der Primärpackmitteloberfläche sowie durch variierende Formulierungsparameter ist keine Aussage über die adsorbierte Proteinmenge möglich. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit unter Einsatz des Modellproteins BSA die folgenden drei analytischen Methoden entwickelt, um die adsorbierte Proteinmenge an verschiedene Primärpackmittel zu quantifizieren: • Coomassieblau-Assay • Micro BCA-Assay • SE-HPLC Methode Beim Coomassieblau-Assay zeigte sich jedoch, dass die erhaltenen Kalibriergeraden sowohl von dem untersuchten Primärpackmittel als auch vom pH-Wert der inkubierten Lösung abhängig waren. Da somit für jeden variierenden Formulierungsparameter sowie für unterschiedliche Primärpackmittel stets neue Kalibriergeraden aufgestellt werden müssten, wurde dieser Ansatz aufgrund des hohen Arbeitsaufwandes nicht weiterverfolgt. Die statistische Versuchsplanung stellt durch gleichzeitige Variation verschiedener Faktoren eine schnelle und effiziente Methode dar, um beispielsweise den Einfluss verschiedener Faktoren auf die adsorbierte BSA-Menge zu untersuchen. Außerdem ist es mittels statistischer Versuchsplanung möglich, Aussagen über Wechselwirkungen von Faktoren zu machen. Dies ist ein weiterer Vorteil gegenüber dem klassischen Versuchsaufbau, bei dem nur ein Faktor pro Versuch variiert wird. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zentral zusammengesetzter Versuchsplan genutzt, um signifikante Faktoren und Wechselwirkungen auf die adsorbierte BSA-Menge zu identifizieren. Zudem konnte in diesem Rahmen die Anwendbarkeit der entwickelten Methoden bestätigt werden. Untersucht wurde der Einfluss folgender Faktoren auf die BSA-Adsorption an Primärpackmitteloberflächen: • BSA-Ausgangskonzentration • Ionenstärke des Puffers • Inkubationstemperatur • Inkubationsdauer • Vialart Als Zielgröße diente die adsorbierte BSA-Menge, die sowohl mittels Micro BCA-Assay als auch mittels SE-HPLC quantifiziert wurde. Der pH-Wert wurde für alle Versuche auf den isoelektrischen Punkt von BSA eingestellt, um eine durch beide Methoden messbare, adsorbierte BSA-Menge sicherzustellen. Die statistischen Analyse identifizierte folgende wichtige Einflussfaktoren auf die adsorbierte BSA- Menge: • BSA-Ausgangskonzentration • Ionenstärke des Puffers • Vialart • Wechselwirkung zwischen der Ionenstärke des Puffers und der Vialart Die Vialart zeigte dabei den größten Einfluss auf die adsorbierte BSA-Menge. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit Methoden, um die Proteinadsorption an Primärpackmittel schnell und kosteneffizient zu untersuchen. Darüber hinaus stellt die statistische Versuchsplanung einen effektiven Ansatz zur Identifizierung eventueller Einflussfaktoren auf die Proteinadsorption dar.
Protein therapeutics are often stored as lyophilisate to guarantee the stability over a longer period. To obtain the solution applicable into the patient, the lyophilisate has to be reconsituted. Protein adsorption to primary packaging can lead to a loss in protein concentration in solution. The decreasing protein content is an issue for the therapy success as well as for the pharmaceutical industry. The adsorption of various therapeutic proteins to different kinds of primary packaging has already been described in literature. Due to different properties of the protein and the surface of the primary packaging as well as due to various formulation parameters, a prediction of the adsorbed amount could not be made. Using the model protein BSA, in the presented work the following three analytical methods were developed to quantify the adsorbed protein amount to different primary packaging: • Coomassieblue-Assay • Micro BCA-Assay • SE-HPLC method The calibration curves of the Coomassieblue-Assay not only depended on the used primary packaging but also on the pH value of the incubated solution. For this reason, a new calibration curve would be necessary for every varying primary packaging or for every differing formulation parameter. Due to the high effort, the Micro BCA-Assay as well as the SE-HPLC method was used to determine the adsorbed BSA amount. Owing to the simultaneous variation of different factors, the statistical tool "'design of experiments"' represents a fast and efficient approach to analyse for example the influence of various factors on the adsorbed amount of BSA. Moreover, the statistical experimental design can identify interactions of factors. This is another advantage compared to the conventional experimental planning, where only one factor is varied at a time. Thus, in the presented work a central composite design was used to identify significant factors and interactions on the adsorbed BSA amount. Furthermore, using the statistical design of experiments, the practicability of the developed methods could be confirmed. The influence of the following factors on the BSA adsorption to primary packaging was analysed: • BSA initial concentration • Ionic strength of the buffer • Incubation temperature • Incubation time • Vial type The adsorbed BSA amount, measured by the Micro BCA Assay as well as the SE-HPLC, was applied as target value. In all experiments the pH value was adjusted to the isoelectric point of BSA to guarantee measureable adsorbed amounts for both methods. The use of statistical experimental design identified the significant influence of the following factors on the adsorbed BSA amount: • BSA initial concentration • Ionic strength of the buffer • Vial type • Interaction between the ionic strength of the buffer and the vial type The vial type had the biggest impact on the adsorbed value. Summing up, this work presents methods for the fast and cost- effective determination of the protein adsorption to primary packaging. Moreover, the "'design of experiments"' is an effective approach to identify potential influence factors on the protein adsorption.
