Apoptose stellt den zentralen Mechanismus des Zelltodes von malignen Zellen bei der Zytostatikatherapie dar. Das Verständnis der molekularen Abläufe der Zytostatika-induzierten Apoptose hat im Hinblick auf häufig auftretende Resistenzen von Tumorzellen gegenüber Zytostatika eine besondere Bedeutung. Es ist außerdem für die Therapie von Neoplasien von Interesse, Möglichkeiten zu untersuchen, die dieser Resistenz entgegenwirken und Tumorzellen wieder empfindlich werden lassen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß TNF-alpha maligne, hämatologische Zellen für Zytostatika- und Ceramid- induzierte Apoptose sensitiviert. Im Mittelpunkt der Untersuchung stand dabei der molekulare Mechanismus der Sensitivierung durch TNF-alpha. Um den zugrundeliegenden Mechanismus der Sensitivierung von Zytostatika-induzierten Zelltod aufzuklären, wurde die gut charakterisierte Hodgkin-Zellinie HD-MyZ auf die Beteiligung der bekannten TNF-alpha-regulierten Signalwege an der Sensitivierung untersucht. Ungeachtet der vollständigen Resistenz von HD-MyZ gegenüber TNF-alpha, führte die Vorbehandlung der Zellen mit TNF-alpha zu einer Verstärkung der Etoposid-, Epirubicin und C2-Ceramid-induzierten Apoptose. Die Expression eines N-terminal verkürzten, dominant-negativen I-kappa B-alphas (IkappaBdn) führte in HD-MyZ IkappaBdn zur Blockierung des Signalweges zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappa B und verhinderte die Expression von hiap-1, eines anti-apoptotischen Zielgens von NF-kappa B. HD-MyZ IkappaBdn zeigten im Vergleich zu den Kontrollzellen (HD- MyZ mock) eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Etoposid und zellpermeablem C2-Ceramid, aber nicht gegenüber Epirubicin. Die Blockierung des NF-kappa B -Signalweges hatte jedoch keinen Einfluß auf den sensitivierenden Effekt von TNF-alpha. Die Verstärkung der Etoposid-, Epirubicin- und Ceramid-induzierten Apoptose durch TNF-alpha ging mit einer vermehrten Aktivierung von Caspase-3 einher. Erstaunlicherweise unterlag die Sensitivierung von HD-MyZ durch TNF- alpha aber einem Caspase-8-unabhängigen Mechanismus. Hierfür sprach die fehlende Aktivierung von Caspase-8; obwohl Caspase-8 sich in einem zellfreien in-vitro System als prinzipiell aktivierbar erwies. Auch die Blockierung der Caspase-8-Aktivität in Anwesenheit des Caspase-8-spezifischen Inhibitors Z -IETD-fmk verhinderte die Sensitivierung der Zellen durch TNF-alpha nicht. Es kam außerdem zu keiner Spaltung von Bid unter sensitivierenden Bedingungen. Diese funktionellen Experimente schloßen eine Beteiligung von Rezeptor- vermittelten Signalwegen und von verbindenden Signalwegen zwischen Rezeptor- und mitochondrialen Apoptosewegen aus. Der Mechanismus der Sensitivierung durch TNF-alpha ging vielmehr mit einer Aktivierung des mitochondrialen Apoptoseweges einher. Der Abfall des mitochondrialen Membranpotentials, die Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien sowie die Aktivierung der Caspase-9 gingen der Apoptose in HD-MyZ zeitlich voraus und wurden durch TNF- alpha verstärkt. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß auch der Ceramid- Signalweg nicht für die TNF-alpha-vermittelte Apoptoseverstärkung verantwortlich ist. Der sensitivierende Effekt von TNF-alpha beschränkte sich nicht auf die Hodgkin-Linie HD-MyZ, sondern konnte auch für die Zytostatika- induzierte Apoptose diverser chronisch myeloischer und akuter myeloischer Leukämie-Linien, sowie für eine B-Zell-Lymphom-Linie nachgewiesen werden. TNF- alpha könnte somit möglicherweise als Adjuvanz bei der Zytostatikatherapie von malignen, hämatologischen Erkrankungen hilfreich sein und außerdem neue Ansätze für das Design therapeutischer Substanzen liefern.
Apoptosis is the central mechanism of cell death mediating the killing of malignant cells upon chemotherapy. Resistance of tumor cells against cytostatic drugs is frequent and this underlines the necessity to understand the underlying molecular events. That is the basis to develop strategies which are able to overcome these resistance mechanisms and to achieve susceptibility of tumor cells to cancer treatment. In the present study, TNF-alpha was characterized as a sensitizer of malignant hematological cells for cytostatic drug- and ceramide-induced apoptosis. The molecular mechanisms mediating this sensitizing effect were the focus of this study. The sensitizing effect of TNF-alpha and the implicated signaling pathways were investigated in the well characterized Hodgkin-derived cell line HD-MyZ. Despite the complete resistance of HD-MyZ cells to TNF-alpha itself, TNF-alpha sensitized for cell death triggered by etoposide, epirubicin and C2-ceramide. The expression of a dominant-negative I-kappa B-alpha (IkappaBdn) resulted in the disruption of the NF-kappa-signaling pathway and blocked the expression of the anti- apoptotic gene, hiap-1. While HD-MyZ IkappaBdn cells were more sensitive for drug-induced apoptosis, the sensitizing effect of TNF-alpha was not effected upon blocking of the NF-kappa B-signaling. The sensitization by TNF-alpha led to a better activation of the mitochondrial apoptosome and the downstream caspase cascade, i.e. caspase-3. Functional experiments showed that interconnecting signaling pathways which link the death receptor signaling to the mitochondrial pathway of apoptosis are not the underlying mechanism in the cell line modell of HD-MyZ since no caspase-8 or bid cleavage was observed. Furthermore, caspase-8 inhibition could not prevent the sensitizing effect of TNF-alpha. Additionally, the activation of the sphingomyelin second messenger pathway as cause for the sensitizing by TNF-alpha was excluded. The sensitizing effect of TNF-alpha was not restricted to the Hodgkin cell line HD-MyZ as TNF-alpha also augmented the drug-induced apoptosis of different chronic and acute leukemia-derived cell lines and the Burkitt-like lymphoma line BJAB. Therefore, activators of this sensitizing pathway could represent a useful strategy to improve chemotherapy of hematological malignancies and could also be the basis for novel drug design.
