Die Enzyme der Proteinkinase C Familie bilden eine Gruppe von Serin/Threonin- Kinasen. Sie erfüllen wichtige Aufgaben in der Signaltransduktion bei Zellwachstum, Differenzierung, Immunreaktion und Cancerogenese. Für die Aufklärung ihrer Funktion ist es gleichermaßen wichtig, die einzelnen PKC- Substrate zu identifizieren und die Auswirkung einer PKC-Aktivierung auf zellulärer Ebene zu analysieren. Die Proteine DAP1, Diff6, TCTP und das PDI-Homologe werden in vivo nach einer Stimulierung mit dem PKC-Aktivator Phorbolester phosphoryliert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob diese Proteine PKC-Substrate sind. Während PDI bereits als aufgereinigtes GST-Fusionsprotein vorlag, waren für die anderen potentiellen PKC-Substrate weder aufgereinigtes Protein noch die cDNAs zugänglich. Diese cDNAs wurden daher zunächst aus Maus 32D Zellen kloniert und in GST-Expressionsplasmide überführt. Nach ihrer Expression und Reinigung wurden alle Proteine in in vitro Kinasereaktionen mit PKCd und PKCe sowie, in Erweiterung der Aufgabenstellung, mit PKCa eingesetzt. Dabei wurde gezeigt, dass die o.g. Proteine keine Substrate dieser PKCs sind, sondern wahrscheinlich Substrate tiefer stehender Kinasen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die nachgelagerten Effekte der PKC- Aktivierung in den promyeloiden 32D Zellen betrachtet. Hierzu wurden die PKC- abhängigen Veränderungen im Transkriptom der Zellen untersucht. Dabei wurde zunächst eine negative Regulation der PKCe-Expression in 32D Zellen durch PKCd festgestellt. Für das tumorassoziierte Protein TCTP trat daneben eine deutliche Steigerung der mRNA-Expression sowohl in den 32D PKCd- als auch in den 32D PKCe-Zellen auf. Weiterhin wurde die mRNA für das antiinflammatorische Protein Lipocortin 1 in 32D Zellen durch PKCd und PKCe stark herunterreguliert. Bei der Untersuchung verschiedener Mitglieder der MAP Kinase Kaskade zeigte sich dagegen eine PKC-abhängige Erhöhung der mRNA- Expression für MAPKAPK2. Durch die Depletion von Lipocortin 1 kann es dabei zu einer dauerhaften Aktivierung des MAPK/ERK Wegs und zur Steigerung entzündlicher Reaktionen kommen. Die PKC-vermittelte Expressionssteigerung von MAPKAPK2 zusammen mit ihrer gleichzeitigen Aktivierung könnte dabei zur Einleitung von Differenzierung und Immunreaktion in den 32D Zellen beitragen.
Protein kinase C forms a group of Serine/Threonine kinases. The members of this family execute important tasks in the signal transduction in growth, differentiation, immune response and cancer. To properly asses their functions it is important to look at both, the PKC substrates and the impact of PKC activation on the intra cellular environment. The first part of this work elucidated the role of the potential PKC substrates DAP1, Diff6, PDI and TCTP. In vivo all of them are phosphorylated after stimulation with the PKC activator phorbol ester. While GST-PDI was available as a purified fusion protein, neither protein nor cDNA was available of the other proteins. So the cDNA of DAP1, Diff6 and TCTP was cloned out of mouse 32D cells and subcloned into expression plasmids containing the gene for GST. After expression and purification, all of the proteins were used in in vitro kinase assays. Here, all of them proved not to be substrates of PKCd, PKCe or PKCa. On the contrary these proteins are probably subtrates for other kinases downstream of PKC. The second part dealt with the downstream effects of the PKC activation in promyelocytic mouse 32D cells. Here changes in the transkriptom of the cells were analyzed on a global basis. First PKCd was shown to downregulate PKCe in the 32D PKCd cells. The mRNA for the translational regulated tumor protein TCTP on the other side was upregulated in both, 32D PKCd and 32D PKCe cells. In cDNA-Array studies other PKC regulated mRNAs were identified and proved by quantitative RT-PCR, consequently. The mRNA for the anti inflammatory protein Lipocortin 1 was downregulated by PKCd and PKCe. Of several members of the MAP kinase pathway, one, the mRNA of MAPKAPK2 was shown to be upregulated by the tested PKCs. The depletion of Lipocortin 1 could lead to a continually activated MAPK/ERK signaling and increased inflammation. Therefore the PKC dependent upregulation of MAPKAPK2 and it?s simultaneous activation might develop a synergistic effect. This could be a step towards the coordinated induction of differentiation and immune response in the 32D cells.
