Xenotransplantation: Reduction of the risk of transmission of porcine endogenous retroviruses (PERV)

Abstract

Xenotransplantation using porcine cells, tissues or organs may reduce the widening gap between demand and supply of human donor organs. However, this may be hampered by the presence of porcine endogenous retroviruses (PERVs), which belong to the γ-retroviruses family and are integrated in the porcine genome and were shown to infect human cells in vitro. Three subtypes of PERVs were identified, PERV-A and PERV-B are human tropic and pose a direct risk and are ubiquitous while PERV-C infect only pig cells and is not present in all pig strains. To date, there are no records of in vivo transmission of PERVs to human or primates following porcine material xenotransplantation. Nevertheless, many of the γ-retroviruses are pathogenic and able to induce tumors and immunodeficiency, which can’t be excluded for PERVs. While breeding animals under SPF conditions may eliminate most of pathogens and exogenous viruses, PERVs are difficult to eradicate from the porcine genome and different strategies must be used to prevent their possible transspecies transmission to human. The present study is a contribution to the evaluation of the risks imposed by xenotransplantation as well as to the prevention of PERV transmission to human. Although PERV-C is not human-tropic, the high infectious PERV-A/C which results from the recombination between PERV-A and PERV-C raised a major concern for xenotransplantation. For this reason choosing PERV-C-free strains with low PERV expression is relevant. The first part of this work addresses the prevalence and the expression of PERV in Göttingen minipigs, which are used for numerous biomedical investigations and are well characterized. PERV-A, -B and -C were found in all animals tested and their expression was low. Infection of human 293 cells was not observed even after mitogen treatment of the pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). RNA interference was used in order to reduce the expression of PERVs in pigs and transgenic pigs expressing PERV-pol-specific shRNA were generated in our group. In the second part of this study the long term effects of PERV specific RNA interference and reduction of PERV expression in these pigs was investigated. Over 3 years, the expression of shRNA was persistent and PERV expression was consistently reduced in the pig PBMCs. We also investigated the expression of PERV and shRNA in different organs of the pigs. Moreover, new triple-shRNA expressing vectors were produced using high efficient siRNAs. The use of these vectors showed a significant improvement in reducing the PERV expression in vitro. The third part focuses on the use of zinc finger nucleases (ZFN) to knockout PERV genes. ZFN specific for the PERV-pol gene were used, and expression of ZFN proteins in porcine kidney cells was demonstrated by different methods. However, the high rate of ZFN expression and the high copy number of PERV proviruses seemed to have cytotoxic effects. ZFN activity couldn’t be detected since a surveyor nuclease assay widely used for detection of ZFN induced gene disruption couldn’t be applied in this case. In the last part vaccine strategies to prevent PERV transmission were investigated. Neutralizing antibodies directed against the recombinant viral envelope proteins gp70 and p15E were produced in hamsters. The neutralization effect of the immunized sera was measured using a qRT-PCR based neutralization assay. To summarize, this work contributed into improving the reduction of PERV expression by RNAi, and addressed for the first time the possibility of the use of ZFNs to knock out a gene with high copy number such as PERV.

Die Xenotransplantation mit porzinen Zellen, Gewebe oder Organe könnte die immer größer werdende Lücke zwischen Nachfrage und Angebot der menschlichen Spenderorgane reduzieren. Dies kann jedoch durch die Anwesenheit von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) erschwert werden. PERVs gehören zu den γ-Retroviren und sind im Genom aller Schweine integriert und können menschliche Zellen in vitro infizieren. Drei Subtypen des PERVs wurden identifiziert, PERV-A und PERV-B sind ubiquitär und besitzen die Fähigkeit humane Zellen in vitro zu infizieren. Daher stellen sie ein unmittelbar Risiko für die Xenotransplantation dar. PERV-C infizieren nur Schweinezellen und sind nicht in allen Schweinestämmen vorhanden. Bis dato, wurde kein Beweis über eine in-vivo-Übertragung von PERVs auf Menschen oder nichthumanen Primaten nach Xenotransplantation von Schweinmaterial erbracht. Dennoch, viele der γ-Retroviren sind pathogen und können Tumore und Immundefizienzen verursachen und dies kann auch für PERVs nicht ausgeschlossen werden. Mit der Aufzucht der Schweinen unter DPF (designated pathogen free) Bedingungen kann es gelingen, die meisten Krankheitserreger und Viren zu eliminieren, was im Fall von PERVs nicht möglich ist, da PERV Proviren bis 100-mal im porzinen Genom integriert sind. Daher müssen andere Strategien verwendet werden, um eine möglich Übertragung auf den Menschen zu verhindern. Die vorliegende Studie ist ein Beitrag zur Bewertung der PERV-Risiken durch die Xenotransplantation als auch zur Vorbeugung von PERV Übertragung auf Menschen. Auch wenn PERV-C nicht humantrop ist, stellt das aus der Rekombination zwischen PERV-A und PERV-C stammende hoch infektiöse PERV-A/C eine besondere Gefahr für die Xenotransplantation dar. Aus diesem Grund sollten ausschließlich PERV C-freie Tiere mit niedrigen PERV Expression benutzt werden. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Prävalenz und der Expression von PERVs in den gut charakterizierten und für zahlreiche biomedizinische Untersuchungen verwendeten Göttingen Minipigs. PERV-A, -B und -C Proviren wurden bei allen getesteten Tieren gefunden, wobei ihre Expression relative niedrig war. Selbst nach Mitogenstimulierung der Schweine-PBMCs konnte keine Infektion menschlichen 293 Zellen beobachtet werden. Basierend auf der RNA-Interferenz wurden in unserer Arbeitsgruppe transgene Schweine generiert, die PERV-pol spezifische shRNA exprimieren und eine reduzierte PERV Expression zeigten. Im zweiten Teil dieser Studie wurde die langfristige Wirkung der PERV spezifischen RNA-Interferenz untersucht und eine Dauerhafte Reduktion der PERV Expression beobachtet. Über 3 Jahre war die Expression von shRNA persistent und die PERV Expression war permanent reduziert in den PBMCs. Die Expression von PERV und shRNA wurde ebenfalls in verschiedenen Organen der Schweine untersucht. Darüber hinaus wurden neue dreifach-shRNA Vektoren mit hoch effizienten siRNAs entwickelt. Die Verwendung dieser Vektoren zeigte eine signifikante Verbesserung bei der Verringerung der PERV Expression in vitro. Der dritte Teil konzentrierte sich auf den Einsatz von Zink Finger Nukleasen (ZFN) zum Knockout von PERV Genen. PERV-pol spezifische ZFN wurden hergestellt und verwendet, und die Expression von ZFN Proteine in der porzine Nierenzelllinie PK15 wurde mittels verschiedenen Methoden nachgewiesen. Allerdings schienen die hohe ZFN Expression und die hohe Anzahl der Kopien der PERV Proviren zytotoxische Effekte zu haben. Außerdem konnte die ZFN Aktivität nicht bewiesen werden, da der Surveyor Nuklease Assay, der oft für die Detektierung von ZFN induzierten Genmutationen verwendet wird, hier nicht angewendet werden konnte. Im letzten Teil wurden Impfstoffstrategien zur Verhinderung der PERV Übertragung untersucht. Neutralisierende Antikörper, die sich gegen die rekombinanten viralen Hüllproteine gp70 und p15E richten, wurden in Hamstern generiert. Der neutralisierende Effekt der immunisierten Sera wurde mit einem qRT-PCR-basierten Neutralisation Assay gemessen. Zussamenfassend kann gesagt werden, dass diese Arbeit trug zur Verbesserung der RNAi-basierte Reduzierung der PERV Expression beitrug. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal ZFN verwendet, um ein Gen mit so hoher Kopienanzahl wie PERV zu mutieren.