dc.contributor.author
Semaan, Marwan
dc.date.accessioned
2018-06-07T15:15:11Z
dc.date.available
2014-07-17T08:17:21.968Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/798
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-5000
dc.description.abstract
Xenotransplantation using porcine cells, tissues or organs may reduce the
widening gap between demand and supply of human donor organs. However, this
may be hampered by the presence of porcine endogenous retroviruses (PERVs),
which belong to the γ-retroviruses family and are integrated in the porcine
genome and were shown to infect human cells in vitro. Three subtypes of PERVs
were identified, PERV-A and PERV-B are human tropic and pose a direct risk and
are ubiquitous while PERV-C infect only pig cells and is not present in all
pig strains. To date, there are no records of in vivo transmission of PERVs to
human or primates following porcine material xenotransplantation.
Nevertheless, many of the γ-retroviruses are pathogenic and able to induce
tumors and immunodeficiency, which can’t be excluded for PERVs. While breeding
animals under SPF conditions may eliminate most of pathogens and exogenous
viruses, PERVs are difficult to eradicate from the porcine genome and
different strategies must be used to prevent their possible transspecies
transmission to human. The present study is a contribution to the evaluation
of the risks imposed by xenotransplantation as well as to the prevention of
PERV transmission to human. Although PERV-C is not human-tropic, the high
infectious PERV-A/C which results from the recombination between PERV-A and
PERV-C raised a major concern for xenotransplantation. For this reason
choosing PERV-C-free strains with low PERV expression is relevant. The first
part of this work addresses the prevalence and the expression of PERV in
Göttingen minipigs, which are used for numerous biomedical investigations and
are well characterized. PERV-A, -B and -C were found in all animals tested and
their expression was low. Infection of human 293 cells was not observed even
after mitogen treatment of the pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
RNA interference was used in order to reduce the expression of PERVs in pigs
and transgenic pigs expressing PERV-pol-specific shRNA were generated in our
group. In the second part of this study the long term effects of PERV specific
RNA interference and reduction of PERV expression in these pigs was
investigated. Over 3 years, the expression of shRNA was persistent and PERV
expression was consistently reduced in the pig PBMCs. We also investigated the
expression of PERV and shRNA in different organs of the pigs. Moreover, new
triple-shRNA expressing vectors were produced using high efficient siRNAs. The
use of these vectors showed a significant improvement in reducing the PERV
expression in vitro. The third part focuses on the use of zinc finger
nucleases (ZFN) to knockout PERV genes. ZFN specific for the PERV-pol gene
were used, and expression of ZFN proteins in porcine kidney cells was
demonstrated by different methods. However, the high rate of ZFN expression
and the high copy number of PERV proviruses seemed to have cytotoxic effects.
ZFN activity couldn’t be detected since a surveyor nuclease assay widely used
for detection of ZFN induced gene disruption couldn’t be applied in this case.
In the last part vaccine strategies to prevent PERV transmission were
investigated. Neutralizing antibodies directed against the recombinant viral
envelope proteins gp70 and p15E were produced in hamsters. The neutralization
effect of the immunized sera was measured using a qRT-PCR based neutralization
assay. To summarize, this work contributed into improving the reduction of
PERV expression by RNAi, and addressed for the first time the possibility of
the use of ZFNs to knock out a gene with high copy number such as PERV.
de
dc.description.abstract
Die Xenotransplantation mit porzinen Zellen, Gewebe oder Organe könnte die
immer größer werdende Lücke zwischen Nachfrage und Angebot der menschlichen
Spenderorgane reduzieren. Dies kann jedoch durch die Anwesenheit von porzinen
endogenen Retroviren (PERVs) erschwert werden. PERVs gehören zu den
γ-Retroviren und sind im Genom aller Schweine integriert und können
menschliche Zellen in vitro infizieren. Drei Subtypen des PERVs wurden
identifiziert, PERV-A und PERV-B sind ubiquitär und besitzen die Fähigkeit
humane Zellen in vitro zu infizieren. Daher stellen sie ein unmittelbar Risiko
für die Xenotransplantation dar. PERV-C infizieren nur Schweinezellen und sind
nicht in allen Schweinestämmen vorhanden. Bis dato, wurde kein Beweis über
eine in-vivo-Übertragung von PERVs auf Menschen oder nichthumanen Primaten
nach Xenotransplantation von Schweinmaterial erbracht. Dennoch, viele der
γ-Retroviren sind pathogen und können Tumore und Immundefizienzen verursachen
und dies kann auch für PERVs nicht ausgeschlossen werden. Mit der Aufzucht der
Schweinen unter DPF (designated pathogen free) Bedingungen kann es gelingen,
die meisten Krankheitserreger und Viren zu eliminieren, was im Fall von PERVs
nicht möglich ist, da PERV Proviren bis 100-mal im porzinen Genom integriert
sind. Daher müssen andere Strategien verwendet werden, um eine möglich
Übertragung auf den Menschen zu verhindern. Die vorliegende Studie ist ein
Beitrag zur Bewertung der PERV-Risiken durch die Xenotransplantation als auch
zur Vorbeugung von PERV Übertragung auf Menschen. Auch wenn PERV-C nicht
humantrop ist, stellt das aus der Rekombination zwischen PERV-A und PERV-C
stammende hoch infektiöse PERV-A/C eine besondere Gefahr für die
Xenotransplantation dar. Aus diesem Grund sollten ausschließlich PERV C-freie
Tiere mit niedrigen PERV Expression benutzt werden. Der erste Teil dieser
Arbeit befasst sich mit der Prävalenz und der Expression von PERVs in den gut
charakterizierten und für zahlreiche biomedizinische Untersuchungen
verwendeten Göttingen Minipigs. PERV-A, -B und -C Proviren wurden bei allen
getesteten Tieren gefunden, wobei ihre Expression relative niedrig war. Selbst
nach Mitogenstimulierung der Schweine-PBMCs konnte keine Infektion
menschlichen 293 Zellen beobachtet werden. Basierend auf der RNA-Interferenz
wurden in unserer Arbeitsgruppe transgene Schweine generiert, die PERV-pol
spezifische shRNA exprimieren und eine reduzierte PERV Expression zeigten. Im
zweiten Teil dieser Studie wurde die langfristige Wirkung der PERV
spezifischen RNA-Interferenz untersucht und eine Dauerhafte Reduktion der PERV
Expression beobachtet. Über 3 Jahre war die Expression von shRNA persistent
und die PERV Expression war permanent reduziert in den PBMCs. Die Expression
von PERV und shRNA wurde ebenfalls in verschiedenen Organen der Schweine
untersucht. Darüber hinaus wurden neue dreifach-shRNA Vektoren mit hoch
effizienten siRNAs entwickelt. Die Verwendung dieser Vektoren zeigte eine
signifikante Verbesserung bei der Verringerung der PERV Expression in vitro.
Der dritte Teil konzentrierte sich auf den Einsatz von Zink Finger Nukleasen
(ZFN) zum Knockout von PERV Genen. PERV-pol spezifische ZFN wurden hergestellt
und verwendet, und die Expression von ZFN Proteine in der porzine
Nierenzelllinie PK15 wurde mittels verschiedenen Methoden nachgewiesen.
Allerdings schienen die hohe ZFN Expression und die hohe Anzahl der Kopien der
PERV Proviren zytotoxische Effekte zu haben. Außerdem konnte die ZFN Aktivität
nicht bewiesen werden, da der Surveyor Nuklease Assay, der oft für die
Detektierung von ZFN induzierten Genmutationen verwendet wird, hier nicht
angewendet werden konnte. Im letzten Teil wurden Impfstoffstrategien zur
Verhinderung der PERV Übertragung untersucht. Neutralisierende Antikörper, die
sich gegen die rekombinanten viralen Hüllproteine gp70 und p15E richten,
wurden in Hamstern generiert. Der neutralisierende Effekt der immunisierten
Sera wurde mit einem qRT-PCR-basierten Neutralisation Assay gemessen.
Zussamenfassend kann gesagt werden, dass diese Arbeit trug zur Verbesserung
der RNAi-basierte Reduzierung der PERV Expression beitrug. Im Rahmen dieser
Arbeit wurden zum ersten Mal ZFN verwendet, um ein Gen mit so hoher
Kopienanzahl wie PERV zu mutieren.
de
dc.format.extent
XIV, 105, XXVIII S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Xenotransplantation
dc.subject
zinc finger nuclease
dc.subject
neutralizing antibodies
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Xenotransplantation: Reduction of the risk of transmission of porcine
endogenous retroviruses (PERV)
dc.contributor.firstReferee
Dr. Joachim Denner
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2014-06-27
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000097114-4
dc.title.translated
Xenotransplantation: Reduzierung des Übertragungsrisikos von den Porzinen
Endogenen Retroviren (PERV)
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000097114
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000015515
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access