Einfluss von C-reaktivem Protein und Pentraxin 3 auf die Kalzifikation glatter Muskelzellen und Zytokinproduktion von Monozyten im Prozess der Arteriosklerose

Abstract

Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz haben ein im Vergleich zur Normalbevölkerung um ein Vielfaches erhöhtes kardiovaskuläres Risiko. Bei diesen Patienten steht als zugrundeliegende Pathologie hauptsächlich die Arteriosklerose im Vordergrund, deren Grundlage der Prozess der vaskulären Kalzifikation ist. Hierbei wandelt sich die Media der Gefäßwand in verkalktes, knochenähnliches Gewebe um. Der Grad an vaskulärer Kalzifikation korreliert stark mit der kardiovaskulären Mortalität und der Prognose des Patienten. Er korreliert weiterhin mit der Höhe verschiedener Inflammationsmarker wie dem C-reaktiven Protein (CRP) und Interleukin 6 (IL-6), die wiederum ihrerseits mit der kardiovaskulären Mortalität korrelieren. Aufgrund dieser Zusammenhänge wird vermutet, dass die chronische Inflammation dieser Patienten, die sowohl durch Urämie-assoziierte Faktoren als auch durch Modalitäten der Hämodialysebehandlung aufrechterhalten wird, mitverantwortlich für deren hohes kardiovaskuläres Risiko ist. Der Erhöhung von CRP bei Dialysepatienten wird nicht nur eine Markerfunktion für Inflammation zugesprochen, sondern es wird auch diskutiert, ob CRP selbst zur Arterioskleroseentstehung beiträgt. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob CRP und PTX3 direkt in vitro eine Steigerung der Verkalkung von glatten Muskelzellen bewirken kann. Ziel dieser Arbeit war es, eine mögliche direkte verkalkende Wirkung von CRP und PTX3 auf VSMC zu untersuchen. Weiterhin sollte der Einfluss auf die Expression des Verkalkungsinhibitors MGP untersucht werden. Darüber hinaus sollte die Frage, ob CRP und PTX3 proinflammatorische Wirkung auf Monozyten habe und sie zur Produktion weiterer Interleukine stimulieren, geklärt werden. Humane glatte Muskelzellen wurden mit einem verkalkungsinduzierenden Medium, was entweder CRP, PTX3, Endotoxin oder keinen weiteren Zusatz enthielt, inkubiert. Anschließend wurde der Grad der Verkalkung sowohl mit der Von Kossa Färbemethode als auch durch Kalziummessung bestimmt. Darüberhinaus wurde nach den Inkubationsversuchen die Expression des Kalzifikationsinhibitors MGP mittels semiquantitativer PCR untersucht. Um die Wirkung der Pentraxine auf Monozyten zu untersuchen, wurden Monozyten von gesunden Probanden isoliert und mit PTX3, CRP oder Lipopolysachariden inkubiert. Anschließend wurde die Produktion der Interleukine 1, 6 und TNF α mittels ELISA bestimmt. Die Endotoxinkonzentration der Pentraxine wurde mehrfach gemessen. Die Versuche wurden auch mit Polymyxin B, einem Endotoxinantagonist wiederholt, um einen möglichen Endotoxineinfluss zu untersuchen. CRP und PTX 3 steigern dosisabhängig die Kalziuminkorporation in verkalkende humane glatte Muskelzellen. In der maximalen CRP-Konzentration zeigte sich eine Verdreifachung, in der maximalen PTX-Konzentration eine Verdoppelung der Kalziuminkorporation. Dies ließ sich mit der Kalziummessung demonstrieren und mit der von Kossa Färbemethode bestätigen. Unter Inkubation von glatten Muskelzellen mit CRP zeigte sich eine reduzierte Konzentration des Verkalkungsinhibtors MGP. Diese war jedoch nicht statistisch signifikant. Endotoxin hat keinen verkalkungsinduzierenden Effekt auf VSMC. PTX3 stimuliert Monozyten zur Produktion von IL-1 und IL-6 um ein Vielfaches. CRP stimuliert Monozyten zur Produktion von IL-1, IL-6 und TNFα um ein Vielfaches. Diese Effekte scheinen von kontaminierendem Endotoxin unabhängig zu sein. Waren CRP und PTX3 zuvor vor allem als Prädiktoren kardiovaskulärer Ereignisse bekannt und galten sie vor allem als korrelierendes Epiphänomen der vaskulären Kalzifikation und der Inflammation, so lässt sich ihnen nun mit den Ergebnissen dieser Arbeit eine aktive Rolle sowohl in der vaskulären Kalzifikation als auch in der Inflammation zuschreiben. Sie verstärken direkt die vaskuläre Kalzifikation in glatten Gefäßmuskelzellen. Außerdem induzieren sie in Monozyten die Produktion von Interleukinen, die bekannt dafür sind, die vaskuläre Kalzifikation ihrerseits zu verstärken. Es konnte den Pentraxinen somit auf verschiedenen Ebenen ein verkalkungsfördernder Effekt nachgewiesen werden. Über die genauen Mechanismen, wie das CRP die Verkalkung induziert, besteht zum jetzigen Zeitpunkt keine Klarheit. Die in dieser Arbeit beobachteten Hinweise auf eine Hemmung des Verkalkungsinhibitoren MGP wäre ein weiterer möglicher vom CRP beeinflusster Mechanismus. Die Ergebnisse dieser Arbeit bezüglich des MGP waren jedoch nicht statistisch signifikant. Die Verstärkung der vaskulären Kalzifikation und der Inflammation durch Pentraxine kann also als ein Grund für die Korrelation von Pentraxinwerten mit kardiovaskulären Ereignissen betrachtet werden. Klinisch bedeutet dies, dass eine Antagonisierung des CRP oder eine Senkung der Inflammation für Patienten mit chronisch erhöhten CRP-Werten im Rahmen einer inflammatorischen Erkrankung wie beispielsweise der chronischen Niereninsuffizienz von Vorteil sein könnte.

Patients suffering from chronic renal railure are at a higher risk for cardiovascular events. The underlying pathology in these patients seems to be the process of vascular calcification. During this process the media of the vascular wall calcifies. At the end of this process, the vascular wall shares many similarities with bone tissue. The degree of vascular calcification correlates with cardiovascular mortality in these patients. Furthermore it correlates with the plasma levels of CRP and Interleukin-6, which also correlate with cardiovascular mortality. Because of these coherences it can be assumed that CRP not only reflects the degree of vascular calcification but may be a cause of arteriosclerosis in patients who suffer from chronic kidney disease. In this thesis a possible direct effect of CRP and Pentraxine 3 on vascular smooth muscle cell calcification was examined. Furthermore the effect of CRP and Pentraxine 3 on expression of MGP in VSMC was analysed. Finally the impact of these acute-phase proteins on interleukin production in monocytes was determined. Human VSMC were incubated with calcification-inducing media containing either CRP, Pentraxine 3 or Endotoxin. Afterwards the degree of vascular calcification was determined via calcium measurement and von Kossa staining method. Also the expression of MGP was determined via semi- quantitative PCR. Furthermore monocytes of healthy donors were isolated and incubated with PTX3, CRP or endotoxine. Afterwards the production of interleukine 1, 6 and TNF α was determined via ELISA. The concentration of endotoxin in the pentraxine probes was measured several times. the experiments were repeated with Polymyxin B, which is used as an endotoxinantagonist. CRP and PTX 3 enhance calcium incorporation in calcifying human vascular smooth muscle cells. In the maximum CRP-concentration a threefold increase versus a two-fold increase in the maximum PTX-concentration of the calciumincorporation could be noted. This was demonstrated with measurement of calcium concentration as well as the von Kossa staining method. VSMC incubated with CRP showed a small, statistically not significant decline in MGP expression. Endotoxin showed no calcification inducing effect in VSMC. PTX3 stimulates monocytes to production of IL-1 and IL-6. CRP stimulates monocytes to production of IL-1 and IL-6 and TNFα. These effects seem to be independent of contaminating endotoxin. While for a long time CRP and PTX3 were perceived as predictors of cardiovascular events, with the results of this thesis an active role in the process of vascular calcification of these acute-phase proteins can be assumed. They enhance vascular calcification of VSMC directly. Furthermore they induce the production of interleukins in monocytes, which again augment vascular calcification themselves. The calcifying effect of CRP and PTX3 could be demonstrated on different levels. However, the mechanisms of how CRP and PTX3 induce vascular calcification in VSMC remain unclear. The results of these works concerning the calcification inhibitor MGP were not statistically significant and can only give a hint. More experiments will be needed. The augmentation of vascular calcification and inflammation can be considered as one reason for the correlation of pentraxine levels and cardiovascular mortality. Clinically these results imply that targeting CRP either by antagonising it or eliminating it could be of profit for patients, who suffer from chronic kidney disease.