The work of this Ph.D. puts the focus on tau, a key protein in Alzheimer’s Disease (AD). During progression of AD, tau becomes abnormally phosphorylated. This high degree of phosphorylation is associated to key events in the disease, such as protein aggregation and destabilization of the neuronal integrity. A natural regulator of tau phosphorylation is O-GlcNAcylation, a post-translational modification, placed on the same residues as phosphate. Here, new synthetic pathways to generate homogeneously phosphorylated or O-GlcNAcylated tau proteins are presented, which are accomplished by combined approaches of native chemical ligation (NCL) and expressed protein ligation (EPL). A new method was established, in which purification was achieved after ligation and desulfurization by means of a traceless photocleavable biotin tag that was installed during solid phase peptide synthesis (SPPS) in synthetic tau fragments. This protocol allowed access to tag-free tau peptides and proteins, which were conveniently desulfurized post-ligation during peptide immobilization, if required. The molecular targets were either phosphorylated or O-GlcNAcylated tau proteins, carrying these post-translational modifications in the AD relevant paired helical filament 1 (PHF-1) epitope (Ser396/400/404). To get more insights into the impact of tau phosphorylation in PHF-1 in cellulo and in vivo, monoclonal antibodies against tau were generated, tri-phosphorylated in this particular epitope. The antibodies were characterized by several experimental settings and enabled the generation of new insights into cellular tau localization. Moreover, the exploration of the diagnostic potential of these new antibody clones was started.
Der Fokus dieser Dissertation liegt auf Tau, einem Schlüsselprotein in der Alzheimer Erkrankung. Im Fortlauf von Alzheimer wird Tau hyperphosphoryliert, wobei der hohe Grad der Phosphorylierung mit Schlüsselereignissen der Krankheit wie der Aggregation von Tau oder dem Verlust der neuronalen Integrität in Verbindung gebracht wird. Die post-translationale Modifizierung der O-GlcNAcylierung wird ebenfalls an Tau beobachtet und gilt als natürlicher Regulator der Phosphorylierung. Hier werden neue Syntheserouten präsentiert, die den Zugang zu homogen-phosphorylierten und O-GlcNAcylierten Tau Derivaten durch kombinatorische Ansätze aus nativer chemischer Ligation (NCL) und exprimierter Protein Ligation (EPL) ermöglichen. Es wurde eine neue Methode entwickelt, die eine Reinigung von Ligationsprodukten durch einen spurlos photospaltbaren Biotin-Tag ermöglichten, der während der Festphasen Peptid Synthese in die synthetischen Peptid-Fragmente eingeführt werden kann. Dieses neuartige Protokoll ermöglichte den synthetischen Zugang zu Tag-freien Tau Proteinen, die ohne großen experimentellen Aufwand während ihrer Immobilisierung entschwefelt werden konnten. Die molekularen Ziele dieser Arbeit waren phosphorylierte oder O-GlcNAcylierte Tau Proteine, die diese post-translationalen Modifikationen im sog. „paired helical filament“ 1 (PHF-1) Epitop (Ser396/400/404) enthalten. Um weiteres Wissen über den Einfluss starker Tau Phosphorylierung in PHF-1 in cellulo und in vivo zu erhalten wurden monoklonale Antikörper gegen dreifach phosphoryliertes Tau entwickelt und diese dann in unterschiedlichen Experimenten charakterisiert. So konnten neue Einsichten über die zelluläre Lokalisation von Tau in Abhängigkeit von der PHF-1 Phosphorylierung gesammelt werden. Darüber hinaus wurde begonnen, das diagnostische Potential der neuen Antikörper Klone zu erforschen.
