Contact dermatitis is one of the most common skin diseases, with a great socio-economic impact. Disperse dyes, which are suitable for dyeing synthetic fibres, are responsible for the great majority of allergic contact dermatitis (ACD) cases to textile dyes. The aim of the present study was to investigate the sensitising potential of various disperse dyes using a biphasic protocol of the local lymph node assay (LLNA) and an in vitro loose-fit coculture based sensitisation assay (LCSA). In the biphasic LLNA, mice were shaved over a surface of approximately 2 cm2 on their backs, and treated using a “sensitisation-challenge protocol”. The shaved surface was treated once daily on days 1 to 3 with 50 l of the test solution. Animals remained untreated on days 4 to 14. On days 15 to 17, mice were treated with 25 l of the test solution on the dorsum of both ears. Mice were sacrificed on day 19 with deep CO2 anaesthesia, the lymph nodes were prepared and various end points, such as ear thickness, ear punch weight, lymph node weight, lymph node cell count, and the proportion of various lymphocyte subpopulations were determined. The results of treated mice were compared to those of the control group treated with the vehicle alone. The LCSA involves single layer of human non- differentiating keratinocytes and of allogenic floating monocytes which are cocultured in serum-free medium in the presence of a cytokine cocktail. The coculture develops into a system consisting of activated keratinocytes and dendritic cell-related cells. The half-maximal increase in CD86 expression on the dendritic cell-like cells (EC50 values) was used to compare the sensitising potential of tested substances. Our results from the LLNA experiments showed that almost all of the tested textile dyes caused a significant increase in lymph node cell count and lymph node weight except Disperse orange 3. Disperse blue 124 and Disperse blue 106 showed the most pronounced increase in cell count and lymph node weight already at low concentrations of 0.003%, followed by Disperse orange 37, Disperse Red 1, Disperse Blue 35 and Disperse Blue 1. Disperse yellow 3 showed the least increase in cell count and lymph node weight parameters among all the textile dyes tested. Based on these results, the disperse dyes could be arranged in four groups on the basis of their sensitising potency in the following decreasing order (in parenthesis: lowest concentration causing a significant increase in lymph node cell number): group 1, strong: Disperse blue 124 and Disperse blue 106 (0.003%), group 2, moderate: Disperse red 1 and Disperse blue 1 (3%), group 3, weak: Disperse orange 37 and Disperse blue 35 (10%) and group 4, very weak: Disperse yellow 3 and Disperse orange 3 (increase at 30% or no increase at 30%). We also observed an increase in ear thickness and ear- punch weight in most of the concentrations tested for various textile dyes. Many allergens cause an increase in ear parameters also, but the relative effects on lymph node parameters are more significant as compared to the ear parameters. We observed a decrease in CD4+ and CD8+ cells and an increase in CD19+, CD45+ and CD45+/1A+ cells in most of the cases, which is characteristic for allergens. The CD4+/CD69+ cells increased in only few experiments mainly with Disperse blue 124 and Disperse blue 106. In the LCSA experiments, the textile dyes can be arranged on the basis of EC50 values in the following decreasing order of their sensitisation potency: Disperse blue 124 > Disperse yellow 3 > Disperse orange 37 > Disperse blue 106 > Disperse red 1 > Disperse blue 35 > Disperse orange 3. The results of the LCSA experiments are mostly comparable with the LLNA experiments. In conclusion, this study shows that the biphasic LLNA protocol was proficient enough to study the sensitisation potential of tested textile dyes. The in vitro loose-fit-coculture assay also gave comparable results to LLNA, and was found to be robust enough to investigate the sensitisation potential of test substances.
Die Kontaktdermatitis ist eine der häufigsten Hautkrankheiten und hat eine große sozio-ökonomische Bedeutung. Verschiedene Farbstoffe, die für das Färben von synthetischen Fasern verwendet werden, sind für die große Mehrheit der Fälle von allergischer Kontaktdermatitis im Zusammenhang mit Bekleidungstextilien verantwortlich. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Sensibilisierungspotential verschiedener Farbstoffe unter Verwendung eines zwei-phasischen Protokolls des „local lymph node assay“ (LLNA) und eines in- vitro Assays („loose-fit co-culture“) (LCSA) zu untersuchen. Im zweiphasischen LLNA wurden Mäuse auf einer Oberfläche von ungefähr 2 cm2 auf dem Rücken rasiert und unter Verwendung eines zweiphasischen Protokolls behandelt. Die rasierte Haut wurde einmal täglich an den Tagen 1 bis 3 mit 50 μL der Testlösung behandelt. Die Tiere blieben an den Tagen 4 bis 14 unbehandelt. An den Tagen 15 bis 17 wurden die Mäuse mit 25 μL der Testlösung auf der Rückseite beider Ohren behandelt. Am Tag 19 wurden die Mäuse mit einer CO2-Überdosis getötet, um die Lymphknoten präparieren zu können und verschiedene Endpunkte wie Ohrstärke, Ohrstanzprobengewicht, sowie Gewicht und Zellzahl der Lymphknoten bestimmen zu können. Darüber hinaus wurden und die relativen Anteile verschiedener Lymphozytensubpopulationen durchflusszytometrisch ermittelt. Die Ergebnisse der behandelten Mäuse wurden mit denen der Vehikel-behandelten Kontrollgruppe verglichen. Im LCSA werden nicht-differenzierte Keratinozyten vom Menschen als Monolayer und allogene Monozyten in einem serumfreien Medium in Anwesenheit eines Zytokingemisches in Kokultur gehalten. Die Kokultur entwickelt sich zu einem System von aktivierten Keratinozyten und Zellen, die dendritischen Zellen ähnlich sind. Die Halb-maximale Zunahme der Expression von CD86 auf den dendritischen Zellen (EC50 Werte) wurde verwendet, um das Sensibilisierungspotential und die Potenz der geprüften Substanzen zu vergleichen. Die Ergebnisse der LLNA-Experimente zeigten, dass fast alle geprüften Textilfarbstoffe, ausgenommen Dispers Orange 3, einen deutlichen Anstieg der Zellzahl und des Gewichtes der Lymphknoten verursachten. Die Farbstoffe Dispers Blau 124 und Dispers Blau 106 zeigten die ausgeprägteste Zunahme dieser Parameter bereits bei niedrigen Konzentrationen von 0,003%, gefolgt von den Farbstoffen Dispers Orange 37, Dispers Rot 1 und Dispers Blau 35. Der Farbstoff Dispers Gelb 3 verursachte unter allen geprüften Textilfarbstoffen die geringste Zunahme der Zellzahl und des Gewichtes der Lymphknoten. Basierend auf den Ergebnissen konnten die verschiedenen Färbemittel in vier Gruppen aufgeteilt werden, und zwar auf der Grundlage ihrer sensibilisierenden Potenz in abnehmender Reihenfolge (die niedrigste Konzentration, die einen signifikanten Anstieg in der Lymphknotenzellzahl verursacht, zuerst aufgezählt): Gruppe 1, stark: Dispers Blau 124 und Dispers Blau 106 (0,003%); Gruppe 2, mäßig: Dispers Rot 1 und Dispers Blau 1 (3%); Gruppe 3, schwach: Dispers Orange 37 und Dispers Blau 35 (10%) und Gruppe 4, sehr schwach: Dispers Gelb 3 und Dispers Orange 3 (Zunahme bei 30% oder keine Zunahme bei 30%). Es wurde auch eine Zunahme der Ohrstärke und des Stanzprobengewichts in den meisten Experimenten beobachtet. Viele Allergene verursachen auch eine geringe Zunahme der Ohrparameter, aber die Effekte auf die Lymphknoten sind im Vergleich damit ausgeprägter. Eine Abnahme an CD4+ und CD8+ Zellen und eine Zunahme von CD19+, CD45+ und CD45+/1A+ Zellen wurde ebenfalls in den meisten Fällen beobachtet, was charakteristisch für Allergene ist. Die CD4+/CD69+ Zellen erhöhten sich nur in wenigen Experimenten, hauptsächlich mit Dispers Blau 124 und Dispers Blau 106. Als Resultat der in vitro-Experimente (LCSA) können die Textilfärbemittel aufgrund der EC50-Werte in abnehmender Reihenfolge ihrer sensibilisierenden Potenz folgendermaßen angeordnet werden: Dispers Blau 124 > Dispers Gelb 3 > Dispers Orange 37 > Dispers Blau 106 > Dispers Rot 1 > Dispers Blau 35 > Dispers Orange 3. Die Ergebnisse der LCSA Experimente sind demnach mit den Resultaten der LLNA Experimente größtenteils vergleichbar. Insgesamt zeigen die Experimente, dass das zweiphasische LLNA-Protokoll geeignet war, das Sensibilisierungspotential der Textilfarbstoffe zu untersuchen. Die LCSA- Experimente ergaben vergleichbare Ergebnisse wie die LLNA-Untersuchungen. Dieser in vitro-Test scheint daher gut geeignet zu sein, um das Sensibilisierungspotential von Fremdstoffen zu untersuchen.
