dc.contributor.author
Schäfer, Michael
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:16:40Z
dc.date.available
2004-10-14T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/7655
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-11854
dc.description
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
1\. EINLEITUNG
1.1. Axonale Wegfindung
1.2. Synaptogenese
1.3. Regeneration im adulten ZNS 5
1.4. L1 CAM und Neurotractin
1.5. L1 CAM 7
1.6. L1-Mutationen verursachen neurologische Defekte im Menschen
1.7. Molekularbiologie der Mutationen
1.8. Bindungspartner von L1
1.9. Neurotractin
1.10. Funktion und Verteilung von Proteinen der IgLON-Familie
1.11. Subzelluläre Verteilung von IgLON-Proteinen 13 1.12. Aufgabenstellung
2\. MATERIAL UND METHODEN
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien
2.1.2. Enzyme
2.1.3. Oligonukleotide
2.1.4. PCR
2.1.5. Plasmide
2.1.6. Bakterienstämme
2.1.7. DNA-Banken
2.1.8. Antikörper
2.1.9. Tiere, Gewebematerial und Zellen
2.1.10. Zellkultur
2.2. Methoden
2.2.1. Molekularbiologische Methoden
2.2.1.1. Kompetente Bakterien, Ligation und Transformation
2.2.1.2. Plasmid-DNA Präparation
2.2.1.3. BAC-DNA Präparation
2.2.1.4. DNA-Sequenzierung
2.2.1.5. PCR
2.2.1.6. Isolierung von DNA-Fragmenten
2.2.1.7. Isolierung genomischer DNA
2.2.1.8. Southern Blot Analyse
2.2.2 Biochemische Methoden und immunologische Methoden
2.2.2.1. Proteinexpression in Bakterien
2.2.2.2. Proteinexpression in eukaryontischen Zellen
2.2.2.3. SDS-PAGE und Western Blot Analyse
2.2.2.4. Kopplung von Proteinen an CNBr-aktivierte Sepharose 4B
2.2.2.5. Herstellung und Aufreinigung von polyklonalen Antikörpern
2.2.2.6. Herstellung von Proteinextrakten aus Zellkulturen und Gewebeproben
2.2.2.7. Enzymatische Deglykosylierung von Proteinen
2.2.2.8. Enzymatische Abspaltung des GPI-Ankers
2.2.2.9. Präparation von Membranfraktionen aus CHO Zellen
2.2.2.10. Affinitätsreinigung von NgCAM aus Plasmamembranen von adultem
Hühnerhirn
2.2.2.11. Herstellung von subzellulären Fraktionen aus dem Mausgehirn
2.2.3. Zellkulturtechniken
2.2.3.1. Präparation und Kultivierung primärer Neuronen
2.2.3.2. Herstellung stabil transfizierter CHO Zellen
2.2.3.3. Kokulturen zur Analyse des mNTRA-vermittelten Neuritenauswuchs
2.2.3.4. Streifenassay (in Kooperation mit Nicolai Savaskan)
2.2.4. In vitro Testsystem zur Analyse des Einflusses von L1-Mutanten auf das
homophil vermittelte Neuritenwachstum
2.2.4.1. Beschichtung von Petriperm Kulturschalen
2.2.4.2. Präparation und Transfektion primärer Neuronen
2.2.4.3. Quantifizierung der Neuritenlängen
2.2.5. Methode zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression von L1 in CHO
Zellen
2.2.6. Histologische Methoden
2.2.6.1. Immunhistologie
2.2.6.2. Immunzytologie
2.2.6.3. Nissl-Färbung
2.2.7. Entorhinale Kortexläsion
2.2.8. Methoden zur Generierung defizienter Mäuse
2.2.8.2. Durchmustern einer genomischen Bank
2.2.8.3. Klonierung des Zielvektors
2.2.8.4. Transfektion, Kultivierung und Selektion von ES Zellen
2.2.8.5. Analyse selektierter ES Zellklone
2.2.8.6. Generierung von chimären und Züchtung von mNTRA-defizienter Mäusen
2.2.8.7. Genotypisierung von Mäusen
3\. Ergebnisse
3.1. L1 CAM
3.1.1. Analyse der Oberflächenexpression pathologischer L1-Mutanten
3.1.2. Entwicklung eines Zellkulturmodells zur Funktionsanalyse pathologischer
L1 Mutanten
3.1.3. NgCAM induziert als angebotenes Substrat das Neuritenwachstum
L1-transfizierter embryonaler Tektum-Neuronen
3.1.4. Die Signalpeptid-Mutante W9S und die nicht-neuronale L1-Isoform ∆E2
bewirken ein vermindertes Neuritenwachstum transfizierter Neurone
3.1.5. Untersuchungen zur Induktion des Neuritenauswuchs durch L1-Mutanten der
Gruppe A
3.1.6. Untersuchungen zur Induktion des Neuritenauswuchs durch L1-Mutanten der
Gruppe B
3.2. Ergebnisse Neurotractin
3.2.1. Klonierung von mNTRA aus der Maus
3.2.2. Bestimmung der Genstruktur von mNTRA
3.2.3. Expression von rekombinanten mNTRA
3.2.4. Herstellung und Spezifität der Antiseren gegen mNTRA
3.2.5. Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen von mNTRA
3.2.6. Untersuchung zur Verteilung von mNTRA in der Maus
3.2.6.1 Expression von mNTRA in verschiedenen Geweben
3.2.6.2. Expression von mNTRA im embryonalen ZNS
3.2.6.3. Expression von mNTRA während der postnatalen Entwicklung im ZNS der
Maus
3.2.6.4. Immunhistologische Untersuchungen zur Verteilung von mNTRA im
Maushirn
3.2.6.5. Biochemische Untersuchung der subzellulären Verteilung von mNTRA im
ZNS adulter Mäuse 3.2.6.6. Immunzytologische Untersuchungen zur subzellulären
Lokalisation von mNTRA
3.2.7. Untersuchungen zur Funktion von mNTRA
3.2.7.1. Analyse des Neuritenwachstums in Kokulturen von hippokampalen
Neuronen und mNTRA-exprimierenden COS-7 Zellen
3.2.7.2. Untersuchungen zur Permissivität von mNTRA im Streifenassay
3.2.7.3. Untersuchungen zur permissiven Wirkung von mNTRA im Vergleich zu PLL
/ Kollagen
3.2.7.4. Untersuchungen zur permissiven Wirkung von CHO-Membranen + mNTRA im
Vergleich zu CHO-Membranen mNTRA
3.2.8. Immunhistologische Untersuchungen zur Verteilung von mNTRA nach
entorhinaler Kortexläsion
3.2.8.1. Quantifizierung der Regulation von mNTRA nach entorhinaler
Kortexläsion
3.2.9. Generierung mNTRA-defizienter Mäuse
3.2.9.1. Klonierung des Zielvektors
3.2.9.2. Überprüfung homolog rekombinierter ES Zellklone und mNTRA-defizienter
Mäuse mittels PCR und Southern Blot
3.2.10 Histologische Analyse mNTRA-defizienter Mäuse
4\. Diskussion
4.1. L1 CAM
4.1.1. Oberflächenexpression von L1-Mutanten in CHO Zellen
4.1.2. Etablierung eines Zellkulturmodells zur Analyse der Auswirkungen
humanpathogener L1-Mutanten auf das Neuritenwachstum
4.1.3. Auswirkungen der Überexpression von L1-Mutanten der Gruppe A auf das
Neuritenwachstum tektaler Neurone
4.1.4. Auswirkungen der Überexpression von L1-Mutanten der Gruppe B auf das
Neuritenwachstum tektaler Neurone
4.2. Neurotractin
4.2.1. mNTRA ist ein Mitglied der IgLON-Familie
4.2.2. mNTRA wird entwicklungsabhängig reguliert und zeigt ein restriktives
Expressionsmuster
4.2.3. Subzelluräre Verteilung von mNTRA
4.2.4. mNTRA verstärkt das Neuritenwachstum hippokampaler Neuronen
4.2.5. Verteilung und Regulation von mNTRA nach entorhinaler Kortexläsion
4.2.6. Vorläufige Analyse mNTRA-defizienter Mäuse
Zusammenfassung
Summary
Literaturverzeichnis
Abkürzungen
Erklärung
dc.description.abstract
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Mitglieder der IgSF mit
unterschiedlichen Fragestellungen untersucht. Der erste Teil der Arbeit
beschäftigte sich mit der Analyse humanpathogener missense Mutationen des
L1CAMs. Träger dieser Mutationen entwickeln zum Teil schwere neurologische
Krankheitsbilder, die unter dem Akronym CRASH-Syndrom zusammengefasst wurden.
Zur Aufklärung molekularer Mechanismen, die zu einer Ausbildung des CRASH-
Syndroms führen, wurden in dieser Arbeit verschiedene in vitro Modelle
angewandt. Dabei wurde die Zelloberflächenexpression mutanter L1-Proteine,
sowie deren Einfluss auf das homophil vermittelte Neuritenwachstum untersucht.
Die Analyse 25 humanpathogener missense Mutationen ergab zum Teil dramatische
Effekte auf die Zelloberflächenexpression mutanter L1-Proteine in CHO Zellen.
Dabei scheinen Mutationen für die eine starke Beeinträchtigung der Struktur
einzelner Domänen angenommen wird, einen stärkeren Einfluss auf die
intrazelluläre Prozessierung und/oder Ligandenbindung aufzuweisen, als solche,
die an der Oberfläche des Proteins exponierte Strukturen beeinflussen.
Weiterhin wurden verschiedene L1-Mutanten in primären Neuronen überexprimiert
und deren Effekt auf das homophil vermittelte Neuritenwachstum untersucht.
Dabei wurde ein funktioneller Zusammenhang zwischen der
Zelloberflächenexpression von L1-Mutanten in CHO Zellen und deren Effekt auf
das Neuritenwachstum hergestellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das
Mausortholog zu Neurotractin, einem zuletzt beschriebenen neuen Mitglied der
IgSF charakterisiert. Hierzu wurden die cDNA von Maus Neurotractin (mNTRA)
kloniert und spezifische Antikörper generiert. Die Analyse der zeitlichen und
räumlichen Verteilung von mNTRA, zeigte einen entwicklungsabhängigen Anstieg
der Expression in verschiedenen Hirnregionen. Immunhistologische
Untersuchungen identifizierten mNTRA auf Subpopulationen von Neuronen im
Cerebellum, Riechkolben, Kortex und im Hippokampus. Des weiteren wurde die
subzelluläre Verteilung von mNTRA immunzytologisch in primären hippokampalen
Neuronen und biochemisch im Hirngewebe adulter Mäuse untersucht. Die
Ergebnisse weisen auf eine präsynaptische Lokalisation hin. Die Funktion von
mNTRA wurde hinsichtlich seines Einflusses auf das Neuritenwachstum mit
unterschiedlichen Testsystemen in vitro untersucht. Dabei wurde ein
permissiver Effekt auf das Neuritenwachstum hippokampaler Neuronen und eine
deutliche Auswachspräferenz hippokampaler Explantate für mNTRA-haltige
Substrate beobachtet. Diese Ergebnisse deuten für mNTRA auf eine Funktion als
attraktives Leitmolekül für das Neuritenwachstum hippokampaler Neuronen hin.
Um eine potentielle plastizitäts-abhängige Regulation von mNTRA zu
untersuchen, wurden entorhinale Kortexläsionen mit Mäusen durchgeführt.
Immunhistologische Untersuchungen zeigten eine Hochregulation von mNTRA im
deafferenzierten Hippokampus und, von besonderem Interesse, auf reaktiven
Astrozyten in der äußeren Molekularschicht des Gyrus dentatus. Die zeitliche
und räumliche Regulation von mNTRA korrespondiert dabei mit der regenerativen
Aussprossung von Axonen. In Anbetracht der attraktiven Wirkung von mNTRA in
vitro, weist die Regulation von mNTRA nach entorhinaler Kortexläsion auf eine
in vivo Funktion bei der Regeneration axonaler Verbindungen hin. Letztlich
wurde eine für mNTRA defiziente Mauslinie generiert, die als Ausgangspunkt für
eine detaillierte Analyse der in vivo Funktion von mNTRA dienen soll.
de
dc.description.abstract
In the present study, two different IgSF-members have been investigated
addressing different aspects. The first part of the study deals with the
analysis of human pathological missense mutations of L1CAM. Carriers of these
mutations exhibit multiple severe neurological symptoms, which has been
combined using the acronym CRASH-Syndrome. Here, different in vitro assays
were utilized to give insights into molecular mechanisms causing the
CRASHSyndrome. The cell surface expression of mutant L1 proteins and their
impact on homophilically mediated neurite outgrowth was tested. Analysis of 25
pathological missense mutations revealed dramatic effects on the surface
expression of mutant L1 proteins in CHO cells. In detail, mutations that are
predicted to affect the structure of individual extracellular domains are more
likely to affect intracellular processing and/or ligand binding than those
mutations affecting surface properties of the molecule. Furthermore, different
L1-mutations have been overexpressed in primary neurons and their effects on
the homophilically mediated neurite outgrowth was examined. Here, the results
were conclusive with respect to the cell surface expression in CHO cells. In
the second part, the mouse homologue of the recently described IgSF-member
Neurotractin has been characterized. For this, the cDNA of mouse neurotractin
(mNTRA) was cloned and specific antibodies have been generated. Western Blot
Analysis of the spatiotemporal distribution showed a developmentally regulated
increase of mNTRA in different brain regions. Immunohistochemistry, using
antibodies against mNTRA, identified its expression on different neuronal
subpopulations in the cerebellum, olfactory bulb, cortex, and the hippocampus.
Moreover, the subcellular distribution of mNTRA has been localized to
presynaptic terminals using immunocytochemistry of primary neurons, and a
biochemical approach using brain tissue of adult mice. Functional studies were
performed examining the influence of mNTRA on neurite outgrowth. Here, a
positive effect on the neurite length of hippocampal neurons and a clear
choice behaviour of outgrowing hippocampal explants for mNTRA was observed.
This implies for mNTRA a function as an attractive guidance cue for the
neurite outgrowth of hippocampal neurons. In order to analyse a potential
plasticity-dependent regulation of mNTRA in vivo, entorhinal cortex lesions
with mice were performed. Immunohistological examinations showed an
upregulation of mNTRA in the deafferented hippocampus, and most interestingly,
on reactive astrocytes in the denervated outer molecular layer of the dentate
gyrus. The spatiotemporal expression regulation of mNTRA after lesion,
corresponds with the timing of regenerative axon sprouting in the outer
molecular layer. Thus, the attractive influence of mNTRA in vitro, and the
regulation after entorhinal cortex lesion, leads to the assumption of an in
vivo function of mNTRA in regenerative axon sprouting. Finally, mNTRA-
deficient mice have been generated, for a detailed analysis of the in vivo
function for mNTRA in future studies.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
missense mutations
dc.subject
immunoglobulin superfamily
dc.subject
IgLON subgroup
dc.subject
entorhinal cortex lesion
dc.subject
neurite outgrowth
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Funktionelle Analyse krankheits-assoziierter Mutationen von L1 CAM und
Charakterisierung eines neuen Mitglieds der Immunglobulinsuperfamilie
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Fritz G. Rathjen
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Robert Nitsch
dc.date.accepted
2004-07-01
dc.date.embargoEnd
2004-10-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2004002647
dc.title.translated
Functional analysis of disease-associated mutations of L1 CAM and
characterization of a novel member of the immunoglobulin superfamily
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000001526
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2004/264/
refubium.mycore.derivateId
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open access